METODI SPETTROSCOPICI

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Tommaso Filippi
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in cui si studiava come la luce (visibile) può essere risolta nelle sue componenti.

Recentemente il significato di spettroscopia è stato ampliato per includere gli studi con altri tipi di radiazione elettromagnetica, quali

1 METODI SPETTROSCOPICI D.C. Harris, Elementi di chimica analitica, Zanichelli Capitoli 7 e 8 Spettroscopia: originariamente era quella branca della scienza in cui si studiava come la luce (visibile) può essere risolta nelle sue componenti. Spettri: grafici dell intensità radiante in funzione della lunghezza d onda o della frequenza. Recentemente il significato di spettroscopia è stato ampliato per includere gli studi con altri tipi di radiazione elettromagnetica, quali raggi X, ultravioletto, infrarosso, microonde, e radiazione a radiofrequenza. 1 PROPRIETÀ ONDULATORIE DELLA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA Molte delle proprietà delle radiazioni elettromagnetiche sono convenientemente descritte trattando le radiazioni come onde sinusoidali. N.B. - La radiazione elettromagnetica non richiede mezzo di supporto per la sua trasmissione. 2

2 Parametri d onda Ampiezza (A): lunghezza del vettore elettrico al massimo nell onda. È una misura della forza del campo elettrico al massimo dell onda. Periodo (p):tempo in secondi richiesto per il passaggio di massimi o minimi successivi attraverso un punto fisso nello spazio. Frequenza (ν): numero di oscillazioni del campo per secondo ( = 1/p). Viene misurata in hertz ( Hz = numero di cicli per secondo) o in s Parametri d onda Lunghezza d onda (λ): distanza lineare fra due punti equivalenti su onde successive (per esempio, massimi o minimi successivi). Velocità di propagazione (V): spazio percorso in un secondo, rapporto tra la lunghezza d onda e il periodo o prodotto della frequenza (s -1 ) per la lunghezza d onda (m). Numero d onda ( ); reciproco della lunghezza d onda (cm -1 ). È direttamente proporzionale alla frequenza (e quindi all energia) della radiazione. La costante di proporzionalità è il reciproco della velocità. = 1 = = 4

3 La radiazione elettromagnetica ha numerose forme, che dipendono dalla sua frequenza, quali: - radiazione a radio frequenza. - microonde (mw) - calore radiante - luce visibile (VIS) - ultravioletto (UV) - raggi X - raggi gamma 5 6

4 La frequenza di un fascio di radiazione (ν) è determinata dalla sorgente e rimane costante. Al contrario, la velocità (V) della radiazione (e quindi la sua lunghezza d onda, λ) dipende dalla composizione del mezzo che essa attraversa, secondo l equazione: V i = λ i /p = ν λ i 7 Nel vuoto, la velocità alla quale la radiazione si propaga è massima: c = 3.0 l0 8 m/s. Nell aria la velocità differisce solo leggermente da c (è circa lo 0.03% in meno). In qualunque mezzo contenente materia, la propagazione della radiazione è rallentata dall interazione con gli atomi o molecole presenti nel mezzo. Il rapporto tra la velocità di propagazione nel vuoto (c) e nel mezzo (V i ), ad una determinata lunghezza d onda, è l indice di rifrazione n i : n i = c/v i L indice di rifrazione dell acqua a 20 C è 1.33, mentre quello del vetro varia da 1.5 a

Si ricorre allora a un modello basato sulle particelle: la radiazione elettromagnetica è trattata come una

5 Proprietà particellari della radiazione elettromagnetica Il modello ondulatorio non è adeguato a spiegare l assorbimento e l emissione di energia radiante. Si ricorre allora a un modello basato sulle particelle: la radiazione elettromagnetica è trattata come una corrente di particelle o pacchetti di energia chiamati fotoni. L energia di un fotone è proporzionale alla frequenza della radiazione: hc E = hν = = λ hcv dove h è la costante di Planck. 9 10

6 Assorbimento di radiazione Un fotone che incontra una molecola può essere assorbito provocando la promozione di uno degli elettroni più esterni dallo stato fondamentale ad uno stato eccitato. E = hν M + hν M* Perchè un fotone sia assorbito occorre che la sua energia sia esattamente uguale alla differenza tra stato eccitato e stato fondamentale. 11 Dopo un breve periodo ( s) la specie eccitata si rilassa al suo stato fondamentale, perdendo l energia in eccesso secondo diverse possibili vie: emissione di calore, decomposizione fotochimica, riemissione fosforescente o fluorescente: M* M + energia Cozzi, Protti, Ruaro, Vol. B. La vita media di M* è molto breve e la sua concentrazione sempre molto bassa; il processo di eccitazione e rilassamento non turba il sistema.

7 13 Assorbimento di radiazione In pratica, il fascio di luce che colpisce il campione viene assorbito (attenuato) selettivamente, cioè in modo diverso per le diverse frequenze che lo compongono. Per un dato campione, l assorbimento dipende in modo unico dalla lunghezza d onda (frequenza) del raggio incidente. Campione 14

Potere radiante (P): energia del raggio che raggiunge una certa area, per secondo. È legata all ampiezza della radiazione.

8 Come si registra l assorbimento di radiazione da parte di una soluzione? SPETTROFOTOMETRO How does a spectrophotometer work? 15 Quali sono le grandezze sperimentali? Potere radiante (P): energia del raggio che raggiunge una certa area, per secondo. È legata all ampiezza della radiazione. Trasmittanza: frazione di radiazione incidente trasmessa dal mezzo: T = P/ P 0 %T = P/ P 0 x 100 Assorbanza: log in base 10 dell inverso della trasmittanza: A = log 10 1/T = - log 10 T = log 10 P 0 /P 16

9 Quali sono le grandezze sperimentali? Per un dato campione, la trasmittanza (e, ovviamente, l assorbanza) dipendono dalla lunghezza d onda. Lo spettrofotometro è in grado di misurare l attenuazione della radiazione in un ampio campo di lunghezze d onda. Spettro d assorbimento Grafico dell attenuazione della radiazione, in funzione della lunghezza d onda, la frequenza o il numero d onda

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11 21 Spettrofotometro a singolo raggio Spettrofotometro a doppio raggio 22

12 La lampada a deuterio Spettro di emissione di una lampada a deuterio

13 MONOCROMATORI I monocromatori sono in generale di due tipi: a reticolo oaprisma. Attualmente quasi tutti i monocromatori sono basati su reticoli a riflessione, in quanto sono meno costosi dei prismi e rendono possibile la progettazione di strumenti più compatti e più semplici. Cuvette per acquisizione di spettri nell UV e nel VIS. 26

14 MATERIALI OTTICI Le celle, le finestre, le lenti e gli elementi dispersivi in uno spettrofotometro devono essere trasparenti nella regione di lunghezze d onda che è stata selezionata per l analisi. 27 Rivelatori fotonici I più utilizzati sono: fototubi, tubi fotomoltiplicatori, fotodiodi al silicio, celle fotovoltaiche, celle fotoconduttrici, dispositivi a trasferimento di carica.

15 Rivelatore a serie di diodi How a Simple UV-visible Spectrophotometer Works 30

Legge di Beer-Lambert-Bouguer Per una radiazione monocromatica, l assorbanza è direttamente

assorbimento molare ed è indicata con ε (cm -1 M -1 ): Pierre Bouguer (1698 1758) è stato un

fisico e astronomo svizzero August Beer (1825 1863) è stato un fisico, chimico e matematico tedesco

Il coefficiente di assorbimento molare dipende invece da parametri sperimentali, quali la

16 Legge di Beer-Lambert-Bouguer Per una radiazione monocromatica, l assorbanza è direttamente proporzionale alla lunghezza del cammino ottico (b) attraverso il mezzo ed alla concentrazione (c) della specie assorbente. A = ε bc Se b èincmec in moli/litro, la costante di proporzionalità è chiamata coefficiente di assorbimento molare ed è indicata con ε (cm -1 M -1 ): Pierre Bouguer ( ) è stato un matematico e geofisico francese Jean-Henri Lambert ( ), è stato un filosofo, matematico, fisico e astronomo svizzero August Beer ( ) è stato un fisico, chimico e matematico tedesco 31 Legge di Beer-Lambert-Bouguer Il valore di b è un parametro strumentale noto (generalmente 1 cm). Il coefficiente di assorbimento molare dipende invece da parametri sperimentali, quali la temperatura, la composizione della soluzione (matrice), la lunghezza d onda d analisi e la natura dell analita. In generale, ε non è noto. Per determinarlo si ricorre alla costruzione della curva di calibrazione. A = ε bc 32

17 ANALISI QUANTITATIVA PER VIA SPETTROFOTOMETRICA: DETERMINAZIONE DELLO IONE NITRITO Retta di calibrazione 33 La legge di Lambert-Beer si applica anche a miscele, ammettendo che non vi siano interazioni tra le specie assorbenti: A totale = A 1 + A 2 + A = ε 1 bc 1 + ε 2 bc 2 + ε 3 bc

18 TITOLAZIONI SPETTROFOTOMETRICHE 35

19 In seguito all assorbimento di un fotone, alcune molecole sono in grado di rilassarsi (tornare cioè allo stato fondamentale) perdendo l energia in eccesso attraverso riemissione fosforescente o fluorescente: M* M + hν Componenti fondamentali di uno spettrofluorimetro

20 Relazione tra intensità di fluorescenza e concentrazione I = k P 0 c dove: P 0 = intensità della radiazione incidente; k = costante c = concentrazione La fluorimetria è una tecnica molto sensibile e adatta all analisi di tracce. Purtroppo molti analiti non sono fluorescenti In diversi casi è possibile derivatizzare l analita in modo da renderlo fluorescente. Un esempio è la determinazione dello ione calcio attraverso la misurazione della fluorescenza del suo complesso con la calceina.

Applicazioni della spettrofluorimetria Osservazione di singole molecole di DNA con i molecular beacon La presenza di una singola catena di DNA o

21 Applicazioni della spettrofluorimetria Osservazione di singole molecole di DNA con i molecular beacon La presenza di una singola catena di DNA o RNA bersaglio in un campione può essere rivelata con questi segnalatori molecolari. Saggi immuno-enzimatici ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

22 ELISA L enzima legato all anticorpo 2 può catalizzare reazioni che producono specie colorate o fluorescenti, facilmente determinabili. Aequorea Osamu Shimomura, Roger Tsien, Martin Chalfie Premi Nobel per la Chimica 2008 Green Fluorescent Protein (GFP) 44

23 Come funzionano le lampade a fluorescenza?

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