TECNICHE SPETTROSCOPICHE I metodi spettroscopici sono metodi di indagine quali- e quanti-tativi

Transcript

1 37 TECNICHE SPETTROSCOPICHE I metodi spettroscopici sono metodi di indagine quali- e quanti-tativi tativi che si basano sull'interazione della materia con i vettori campo elettrico e campo magnetico di cui si compone una radiazione elettromagnetica. Un corpo quando è colpito da una radiazione luminosa può essere in grado di riflettere la radiazione incidente, di assorbirla integralmente, oppure di assorbirla selettivamente a certe lunghezze d'onda producendo la riduzione dell' energia della radiazione, talvolta t in misura notevole, in corrispondenza alcune specifiche e caratteristiche lunghezze d'onda. L'assorbimento di energia può essere misurato mediante l'impiego o di strumenti detti spettrofotometri che registrano la variazione di assorbimento di intensità della radiazione in funzione della lunghezza d'onda o della frequenza usata. I I grafici ottenuti da questi strumenti sono chiamati spettri e sono utili per ottenere informazioni ben precise sulla struttura delle molecole che li hanno originati.

2 Natura dell energia energia raggiante La luce raggiante è costituita da onde elettromagnetiche, cioè da campi elettrici e magnetici oscillanti perpendicolari alla direzione di d propagazione. I vettori E ed H descrivono una sinusoide. Equazioni fondamentali ν = c λ E = h ν E = h c λ 38 λ= lunghezza d onda (nm) ν= frequenza (cicli/sec o Hz) h = costante di Plank ( J. Sec) c = velocità della luce nel vuoto ( cm/sec)

3 ASSORBIMENTO DELLA RADIAZIONE ELETTROMAGNETICA DA PARTE DELLE MOLECOLE La materia può essere considerata come un sistema costituito da un insieme di particelle (atomi o molecole) costantemente in movimento di traslazione, rotazione e vibrazione lungo i legami. Anche gli elettroni ettroni si muovono velocemente e ciascuno di questi movimenti contribuisce ali'energia totale del sistema. 39 Il passaggio dallo stato fondamentale ad uno stato eccitato prende il nome di transizione,, e si verifica soltanto se l energia del fotone assorbito corrisponde esattamente alla differenza di energia dei due stati interessati. E t = energia traslazionale E r = energia rotazionale E v = energia vibrazionale E e = energia elettronica quantizzate

4 LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO UV-vis transizioni elettroniche (E = kcal/moli) 39 Raggi X transizioni elettroniche di core I.R. transizioni roto-vibrazionali raggi cosm ici raggi gam m a raggi X UV-VISIBILE VISIBILE infrarosso radar radio Raggi gamma (rad. Ionizzanti) 1 lontano UV nm vicino UV visibile

5 LO SPETTRO DI ASSORBIMENTO 41 Diagramma che riporta l entitl entità della radiazione assorbita (assorbanza( assorbanza) ) in funzione della lunghezza d ondad onda. Nell ultravioletto si presenta come larghe bande in un ampio intervallo di lunghezze d onda d a causa della presenza dei sottolivelli rotazionali e vibrazionali che accompagnano ciascun livello elettronico.

6 LA LEGGE DI LAMBERT-BEER BEER I 0 k = a. c I I = I 0. e - a c l I = I 0. e - k l nel caso di soluzioni.... I I 0 = e - a c l 42 I 0 = intensità della radiazione incidente I = l intensità della radiazione che emerge dal campione (radiazione trasmessa), k= coefficiente di assorbimento del campione alla lunghezza d onda considerata l = spessore del campione attraversato dalla luce ln I I 0 = - a. c. l ln I 0 I = a. c. l

7 I I = T 0 TRASMITTANZA ( 0 < T < 1) A= log I 0 1 = log I T ASSORBANZA ( ESTINZIONE o DENSITA OTTICA) = log = a. c. l T A = ε. c. l legge di Lambert-Beer ε = a / (COEFFICIENTE DI ASSORBIMENTO MOLARE dipende dalla sostanza ed ha dimensioni M -1. cm -1 ) L equazione di Lambert-Beer è l equazione di una retta solo in soluzioni diluite (< 10-2 M) dove i centri assorbenti agiscono indipendentemente gli uni dagli altri. In soluzioni più concentrate si osservano spesso delle deviazioni dalla linearità.

8 Transizioni elettroniche e cromofori Nello stato fondamentale le molecole contengono gli elettroni di valenza in tre tipi di orbitali: CROMOFORI Gruppi funzionali che danno luogo ad un assorbimento con valori caratteristici di λ ed ε. 44 tipi di TRANSIZIONI σ π TRANSIZIONI dell UV UV-VISIBILE VISIBILE n π π π PRINCIPALI CROMOFORI DELL ULTRAVIOLETTO Energia livelli elettronic i n π σ σ σ n σ cadono nel lontano uv (sperimentalmente inaccessibile)

9 Spettrofotometro E lo strumento che consente di misurare l assorbanza l o la trasmittanza di una soluzione in funzione della lunghezza d onda d incidente. Genera una ddp proporzionale alla E della luce incidente 45 SORGENTE Mono- Cromatore Cella portacampione RIVELATORE Prisma o Reticolo REGISTRATORE Lampada a tungsteno ( nm) Lampada al deuterio ( nm) Cuvette di quarzo A λ Spettro di assorbimento

10 Impiego della Spettrofotometria La spettroscopia UV-Visbile Visbile e largamente impiegata sia per scopi qualitativi che per scopi quantitativi. Analisi qualitativa Spettro di assorbimento 46 (cromofori presenti nella molecola) A 200 λ max λ

11 ANALISI QUANTITATIVA (Legge di Lambert-Beer Beer) 47 Dato che esiste una relazione lineare tra l assorbanza l di una sostanza in soluzione e la sua concentrazione, è possibile determinare la concentrazione incognita di un analita per mezzo della misura della sua assorbanza allo spettrofotometro. Per fare ciò è necessario conoscere l ed ε. Per ricavare ε si costruisce la Retta di Taratura misurando (alla lunghezza d onda d scelta λ max ) l assorbanza l di soluzioni a concentrazione nota. Il coefficiente angolare della retta ottenuta interpolando i punti è a = ε. l. Misurando l assorbanza l della soluzione incognita è possibile ricavare la concentrazione. A ε = coefficiente di assorbimento molare y = a x A = ε. c. l c

12 Esperienza di laboratorio 48

13 49

14 50

15 51

16 52

17 53

18 54 (nel saggio) (nel volume totale di urina delle 24 h) X urine = 5,54 (µg/ml)(. 10 = 55,4 (µg/ml)(. V (ml) = X tot (µg) (fattore di diluizione) (volume totale di urina)

19 55

20 POTENZIOMETRIA 56 TECNICA ANALITICA CHE HA L'OBIETTIVO DI RICAVARE INFORMAZIONI QUALI-QUANTITATIVE QUANTITATIVE SU ANALITI IN SOLUZIONE MEDIANTE LA MISURA DELLA DIFFERENZA DI POTENZIALE (O FORZA ELETTROMOTRICE) DI UNA CELLA COSTITUiTA DA UN ELETTRODO INDICATORE ED UN ELETTRODO DI RIFERIMENTO. Elettrodo indicatore Elettrodo di riferimento il potenziale varia al variare della concentrazione dell analita; il potenziale rimane costante

21 1. ELETTRODI METALLICI 57 - I specie, II specie e III specie - Reazione redox - Legge di Nernst (E= E (scambio di elettroni) E= E /n log [ox]/[red]) 2.ELETTRODI A MEMBRANA - a membrana di vetro - a membrana cristallina - a membrana liquida no reazione redox, ma reazione di scambio con ioni presenti sulla membrana. Questo genera un potenziale di membrana dipendente dalla concentrazione dell analita Legge simile all equazione di Nernst

22 ELETTRODO A VETRO Tubo in vetro (o plastica) a pareti spesse, alla cui estremità e' saldata una sottile membrana di vetro sensibile alla variazione della concentrazione di ioni [H 3 O + ], quindi alla variazione di ph. 58

23 Funzionamento della membrana 1 a Fase (Idratazione). Quando la membrana di vetro ( 59 Quando la membrana di vetro (cornig 015) è a contatto con due soluzioni acquose da entrambi i lati, le due facce vengono no idratate per una profondità di circa nm.. Nei due strati idratati si stabilisce un equilibrio di scambio tra gli ioni H +, presenti nella soluzione acquosa, e degli ioni Na + o Li + che occupano le posizioni reticolari dello scheletro di silicato o (SiO 2-3 ) costituente la membrana. Nelle parti idratate si forma acido silicico (H + Gl - = H 2 SiO 3 ). H + acq + + acq + Na Gl = Na + H Gl + (Gl - = glass) (H + Gl - ) = ac. silicico Soluzione interna (HCl 0.1 M) H + Soluzione esterna ([H + ] incognita) H + ddp Strati idratati nm (ac. silicico H + Gl - )

24 2 a FASE (dissociazione): L acido silicico (H + Gl - ) presente nelle zone idratate della membrana è sottoposto ai due equilibri di dissociazione: 60 + (H Gl + (H Gl ) ) s s i e = = H H + acq + acq + (Gl + (Gl ) s ) i s e L equilibrio sarà spostato più a destra o più a sinistra a seconda del ph delle due soluzioni a contatto con la membrana. In particolare, la parte di membrana a contatto con la soluzione contenente la [H + ] più elevata (ph più basso) sarà meno dissociata, mentre la parte di membrana a contatto con la soluzione s contenente la [H + ] più bassa (ph più alto) sarà più dissociata. Come conseguenza, la superficie della membrana dove la dissociazione è maggiore assume una carica negativa rispetto all'altra. È questa differenza di carica tra le due superfici interna ed esterna che genera un POTENZIALE DI INTERFASE il cui valore dipende dal rapporto delle concentrazioni degli ioni i idronio nelle due soluzioni. Tale potenziale, misurato rispetto ad un elettrodo e di riferimento, viene utilizzato come parametro analitico nella misura potenziometrica del ph.

25 Potenziale dell elettrodo elettrodo a vetro 61 La misura del ph in laboratorio si effettua comunemente per via potenziometrica usando come elettrodo indicatore un elettrodo a membrana di vetro. Il potenziale di cella è dato da: E E = E Rif. - E ind. + E j Potenziale di cella E = E ind. E0 + 0, log a E 0 + 0, log a = E Rif. - E E + E j a = [H + ] E ind. = E Rif. - E E + E j E j = Potenziale di giunzione liquida (dovuto alla diversa mobilità degli ioni) E 0 = Potenziale normale: nel caso dell elettrodo a vetro contiene alcune costanti + il pot. di asimmetria - log a = ph = ( E - E Rif. - E j + E 0 ) / E E = K ph La costante K include i potenziali dell elettrodo elettrodo di riferimento, il potenziale di giunzione ed il potenziale di asimmetria che si ricavano mediante misura di FEM di soluzioni a ph noto (standard)

26 PROPRIETA DEGLI AMMINOACIDI H 2 N CHR COOH 62 H 3 N CHR COO

27 Quando un amminoacido è posto in acqua la forma dipolare si mette all equilibrio con le due forme anionica e cationica,, agendo sia da acido che da base: 63 forma anionica forma zwitterionica forma cationica

28 Amminoacidi: punto isoelettrico 64 Cosa succede quando la soluzione di un amminoacido viene posta in un campo elettrico? Gli ioni migrano in dipendenza del ph: forma anionica ione dipolare zwitterione forma cationica Pertanto, il punto isoelettrico è quel valore di ph al quale la forma zwitterionica dell amminoacido è massima,, mentre la concentrazione della forma anionica e della forma cationica sono uguali.

29 Calcolo del ph isoelettrico. Consideriamo la glicina nella forma protonata. Essa possiede due protoni acidi con due valori di Ka molto diverse. 65 Ka H 3 N CH 2 COOH (Forma cationica) Ka Si comporta come un ACIDO BIPROTICO: DUE EQUILIBRI DI DISSOCIAZIONE H 3 N CH 2 COOH + H 2 O (Forma cationica) [AA + ] (Forma zwitterionica) [AA] Ka 1 Ka 2 H 3 N CH 2 COO + H 3 O (Forma zwitterionica) [AA] H 3 N CH 2 COO + H 2 O H 2 N CH 2 COO + H 3 O (Forma anionica) [AA - ] Ka 1 = Ka 2 = [AA] [H 3 O + ] [AA + ] [AA - ] [H 3 O + ] [AA]

30 Ka 1 = Ka 2 = [AA] [H 3 O + ] [AA + ] [AA - ] [H 3 O + ] [AA] [AA] = [AA] = Ka 1 [AA+ ] [H 3 O + ] [AA - ] [H 3 O + ] Ka [AA + 1 ] [H 3 O + ] = [AA - ] [H 3 O + ] Ka 2 66 Ka 2 [AA + ] = [AA - ] Ka 1 al punto isoelettrico [H 3 O + ] = [H 3 O + ] Ka 2 = Ka 1 Ka 2. [H 3 O + ] 2 pi [H 3 O + ] pi. pi = Ka 1 Ka 2 pi = 1 2 ph isoelettrico (pka + 1 pka 2 )

31 Rappresentazione grafica del p.to isoelettrico PUNTO ISOELETTRICO (pi): Valore di ph al quale [AA] è massima e [AA + ] = [AA - ] 67 [aa] [AA + ] [AA] massima concentrazione dello zw itterione [AA - ] [AA + ] = [AA] [AA] = [AA - ] 0 ph 14 pka 1 [AA + ] = [AA - ] pi pka 2

32 DETERMINAZIONE DEL PUNTO ISOELETTRICO DELLA GLICINA MEDIANTE TITOLAZIONE POTENZIOMETRICA Obiettivo: : determinare il valore del punto isoelettrico (P.I.) della glicina, valutando le costanti di dissociazione acida della glicina protonata (acido biprotico caratterizzato da Ka e Ka 1 2 ) mediante titolazione potenziometrica con NaOH. 1 a fase: protonazione della glicina con una q.tà stechiometrica di HCl 68 H 3 N CH 2 COO forma zwitterionica + HCl H 3 N CH 2 COOH + Cl forma cationica 2 a fase: : titolazione con NaOH e costruzione della curva 1) H 3 N CH 2 COOH + NaOH forma cationica H 3 N CH 2 COO forma zwitterionica +H 2 O+ Na 1 p.to equiv. 2) H 3 N CH 2 COO + NaOH H 2 N CH 2 COO + H 2 O + Na forma zwitterionica forma anionica 2 p.to equiv.

33 ph 10 H 3 N CH 2 COO zwitterione H 2 N CH 2 COO forma anionica 69 Curva di titolazione 69 pka 2 1 ((~10) ~ ph= pka 2 log [AA] [AA - ] H 3 N CH 2 COO p.to isoelettrico pi= ½ (pka +pka ) 1 2 (~ 6) 5 H 2 N CH 2 COO soluzione tampone pka 1 ( ~ 2.5) ph= pka 1 log [AA + ] [AA] H 3 N CH 2 COOH forma cationica 0 0 ½ del 1 vol equivalente 1 p. to equivalente 3/4 del 2 vol equivalente 2 p. to equivalente ml titolante (NaOH) H 3 N CH 2 COOH H 3 N CH 2 COO soluzione tampone

34 PROCEDURA SPERIMENTALE: 1. RACCOLTA DATI 70 Elettrodo indicatore

35 2. ELABORAZIONE 71 Costruire la curva di titolazione riportando su carta millimetrata ta i valori di ph (ordinate) in funzione del volume di NaOH (ascisse).

36 3. DETERMINAZIONE GRAFICA DEL P.TO ISOELETTRICO (P.TO DI FLESSO) 1. Tracciare le rette tangenti che estrapolano i tratti quasi rettilinei della curva di titolazione. 2. Individuare i punti A e B situati nei tratti quasi rettilinei da parti opposte rispetto al a flesso e tracciare per essi due rette parallele all asse asse y. 3. Individuare i punti di incontro P e Q tra le tangenti e le parallele all asse asse y Individuare i punti medi dei 7 segmenti PA e BQ e ph congiungerli L intersezione di questo segmento con la curva di 5 titolazione fornisce il 1 p.to pi equivalente 4 6. Il p.to isoelettrico è il corrispondente valore 3 dell ordinata del 1 p.to equivalente. pka Ricavare graficamente i valori 1 di pka 1 e pka ½ 1 p.to equiv. 1 p.to equiv. 2 rispettivamente ad ½ del 1 p.to eq. e ¾ del 2 p.to eq. e verificare che il ph isoelettrico è la loro semisomma. 72