Sintesi chimica del DNA

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1 Sintesi chimica del DNA

2 Sintesi chimica di oligonucleotidi Per la sintesi vengono utilizzati fosforamidi dei vari nucleotidi. La fosforamide contiene un buon gruppo uscente che promuove la reazione di formazione di un legame fosfoestere (fosfito). Il monomero attivato aggiunto contiene dimetossitritile (DMT) che protegge il 5 OH e un gruppo β-cianoetilico di protezione del gruppo ossidrilico 3.

3 Sintesi in fase solida di oligonucleotidi Nella sintesi su fase solida l addizione di nucleotidi avviene in direzione 3-5, contraria alla direzione di sintesi enzimatica. Il nucleotide 3 terminale è legato covalentemente con il gruppo 3 alla fase solida e poi il suo 5 viene deprotetto dal gruppo DMT. Ad ogni ciclo un nucleotide viene aggiunto, reagisce con il suo 3 attivato con la fosforamidite e si lega al 5 del nucleotide associato alla fase solida. Successivamente il 5 del nucleotide appena aggiunto viene deprotetto e la reazione può essere di nuovo effettuate con un altro nucleotide. Dopo la sintesi i legami fosfoestere vengono ossidati da fosfiti a fosfati

4 Sintesi in fase solida di oligonucleotidi La fase di capping serve ad inattivare le estremità 5 OH che non hanno reagito ed impedire la sintesi di oligonucleotidi con sequenze diverse da quella selezionata (resteranno di lunghezza inferiore)

5 Efficienza nella sintesi su fase solida

6 Sequenziamento

7 Sequenziamento con idrolisi chimica (Maxam and Gilbert 1977) (formic acid) Uso di reagenti chimici che alterano una o al massimo due basi. La base alterata viene essere rimossa (attraverso riscaldamento) e una seconda reazione con piperidina porta alla rottura della catena polinucleotidica nel sito abasico I vari frammenti ottenuti dopo l idrolisi nelle diverse condizioni sono separati su gel Le molecole di DNA, sottoposte alie differenti reazioni chimiche e specifiche per le varie basi, sono marcate ad una estremità. Questo permette di visualizzare solo i frammenti che iniziano con l estremità marcata e terminano con il sito di taglio e la misura loro lunghezza identifica la posizione della base che è stata alterata nella specifica reazione

8 Lettura della sequenza di DNA Esempio dei frammenti, contenenti l estremità marcata, ottenibili con l idrolisi chimica specifica per la guanina di una molecola di DNA

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10 Sequenziamento chain-terminator o metodo con dideoxinucleotidi (Sanger, 1977) Metodo enzimatico che richiede l uso di una DNA-polimerasi e specifici primer La reazione è condotta in presenza di paricolari nucleotidi,ididesossinucleotidi, che se incorporati portano alla prematura terminazione della sintesi del DNA perchè privi del 3 OH Principio della tecnica 3 T T T T 5 5 primer 3 dda dda dda dda Nella reazione oltre al datp è presente anche il ddatp (in genere in rapporto 1:10). Quando occasionalmente viene incorporato il ddatp la reazione di polimerizzazione si interrompe e la lunghezza del frammento mi fornisce la posizione della base usata come ddntp

11 Le molecole di DNA da sequenziare vengono sottoposte a quattro differenti reazioni, in ognuna delle quali è presente un ddntp. Le reazioni di sintesi del DNA vengono innescate da uno stesso prime opportunamente marcato per permettere la migliore visualizzazione dei frammenti prodotti. I frammenti prodotti durante la sintesi vengono successivamente separati su gel e, anche in questo caso, la misura loro lunghezza identifica la posizione della base che è stata utilizzata come ddntp nella reazione di polimerizzazione.

12 Lettura della sequenza di DNA

13 Sequenziamento automatico Nelle quattro differenti reazioni di polimerizzazione, oltre che essere utilizzati differenti ddntp, la sintesi del DNA viene innescata dallo stesso primer ma marcato con quattro fluorofori differenti. Questo permette di distingure i frammenti che sono terminati dal ddatp o da un altro ddntp perché hanno una fluorescenza differente. I prodotti delle quattro reazioni vengono riuniti e analizzati sullo stesso gel. La separazione elettroforetica permetterà di distinguere i vari frammenti in base alle dimensioni e lo specifico colore di fluorescenza indicherà la base che si trovava in quella posizione.

14 Sequenziamento automatico I prodotti delle quattro reazioni vengono riuniti e separati in continua su gel o elettroforesi capillare. Un rivelatore è posto alla fine del ge,l o del capillare, e analizza l intensità ed il colore del frammento che viaggia nel gel, permettendo cosi di avere informazioni sul tipo di base presente al termine di quel frammento. Il risultato è una serie di picchi consecutivi, che rappresentano i vari frammenti eluiti a dimensioni crescenti (ognuno è più lungo di una base) ed il colore identifica la base terminale (permettendo di leggere direttamente la sequenza del frammento).

15 NGS Next Generation Sequencing

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17 Illumina

18 Ion torrent e Pyrosequencing

19 La PCR

20 3 5 La Polymerase Chain Reaction o PCR Come funziona? Miscela di reazione Replicazione in vitro di determinati tratti di DNA, selezionati tramite specifici primers 5 3 Primers d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Denaturazione 95 C 3 Taq Ripetizione del ciclo Taq 5 3 Estensione 3 Taq 5 3 Annealing C Taq 3 Estensione 72 C

21 La PCR (il primo ciclo)

22 La PCR (secondo ciclo)

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24 CICLO QUANTITA' DI DNA

25 Applicazioni della PCR Amplificazione selettiva di specifiche regioni di DNA (la sequenza di DNA amplificato è delimitata dai primers e la loro specificità determina la qualità dell amplificazione Indicazioni sulla presenza di specifiche sequenze di DNA in un campione. Se presenti verranno amplificate e quindi rivelabili tramite elettroforesi altrimenti possono essere considerate assenti. In campo diagnostico permette di determinare infezioni virali (esempio retrovirus o virus difficili da diagnosticare), altri patogeni, presenza di DNA estraneo, ecc. Clonaggio di sequenze informazionali (geni o altre regioni di DNA), a patto di conoscere le sequenze delle regioni limitrofe (inizio e fine) per costruire specifici primers. Genotipizzazione (DNA fingerprinting)

26 Genotipizzazione tramite PCR

27 ANALISI DELLE STR Le STR (Short Tandem Repeats) sono sequenze di 2-6 bp ripetute da 3 a 50 volte che si trovano all interno di regioni introniche Sono note anche come DNA microsatellite o simple sequence repeats (SSRs) Le STR possono essere amplificate mediante PCR La regione ripetuta è di lunghezza variabile mentre le regioni adiacenti, dove si legano i primers, sono costanti Gli individui possono essere omozigoti (i due alleli hanno la stessa lunghezza) o eterozigoti (i due alleli hanno lunghezze diverse)

28 Amplificazione di una STR 195 bp 170 bp TCAT repeat unit

29 Frequency Frequenza allelica nelle STR Number of repeats TH01 Marker Caucasians (N=427) Blacks (N=414) Hispanics (N=414) *Proc. Int. Sym. Hum. ID (Promega) 1997, p. 34

30 FBI s CODIS DNA Database

31 Loci STR del CODIS TPOX D3S1358 D5S818 D8S1179 TH01 VWA FGA CSF1PO D7S820 AMEL D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 AMEL 13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions

32 Analisi comparativa delle STR Amplificazione contemporanea di più STR mediante Multiplex PCR Ridotta probabilità di errori introdotti con la PCR (Informazione nella lunghezza e non nella sequenza) Risultati uniformi Possibilità di analizzare campioni in tracce Analisi mediante DNA-PAGE o elettroforesi capillare Rapidità nella separazione Comparazione e/o identificazione L analisi comparativa di 13 STR permette di ridurre la probabilità di un random match fino a 1 su Disponibilità di kit commerciali e apparecchiature dedicate

33 Human identity testing Casi forensici analisi comparative tra sospettati e prove Test di paternità/maternità identificazione padre/madre Studi storici Studi su persone scomparse Disastri di massa identificazione Military DNA dog tag (alternativa alla piastrina) Creazione di DNA databases relativi a criminali condannati

34 Sangue Liquido seminale Saliva Urine Capelli Denti Ossa Tessuti Campioni analizzabili

35 Procedura di analisi

36 Color Separation Esempio di un Forensic STR Multiplex Kit AmpFlSTR Profiler Plus Kit available from PE Biosystems (Foster City, CA) 100 bp 200 bp 300 bp 400 bp Size Separation D3 vwa FGA 5-FAM (blue) A D8 D21 D18 JOE (green) D5 D13 D7 NED (yellow) GS500-internal lane standard ROX (red) 9 STRs amplified along with sex-typing marker amelogenin in a single PCR reaction

37 Two different individuals Human Identity Testing con Multiplex STRs AmpFlSTR SGM Plus kit D3 amelogenin D19 D8 TH01 VWA D21 FGA DNA Size (base pairs) D16 D18 D2 probability of a random match: ~1 in 3 trillion amelogenin D3 Results obtained in less than 5 hours with a spot of blood the size of a pinhead D19 D8 TH01 VWA D21 FGA D16 D18 D2 Simultaneous Analysis of 10 STRs and Gender ID

38 PCR quantitativa

39 Amplificazione e quantificazione di specifici frammenti di DNA Amplificazione attraverso l uso della Polymerase Chain Reaction o PCR (reazione a catena della polimerasi) Quantificazione in tempo reale del DNA amplificato mediante l uso di sonde fluorescenti (molecole in grado di assorbire la luce e riemetterla ad un determinato colore) L insieme di queste due tecniche prende il nome di Real-time PCR

40 DNA amplificato (scala log) Limite della PCR In teoria la quantità di DNA amplificato raddoppia ad ogni ciclo e il suo quantitativo può essere espresso dalla formula Teorico Prodotto (T) = (DNA iniziale) x 2 n (n = numero di cicli) In realtà dopo un certo numero di cicli la quantità di DNA non aumenta più esponenzialmente (consumo dei substrati, ovvero I precursori per costruire le catene di DNA, e inattivazione dell enzima) Reale Numero di cicli

41 Campioni con diverso contenuto iniziale dello stesso DNA e sottoposti ad amplificazione mediante PCR seguiranno delle cinetiche di amplificazione differenti 4 unità 1 unità 1/8 di unità

42 Determinazione del quantitativo di DNA amplificato SYBR Green I

43 Il SYBR Green I agente fluorescente intercalante Estensione 3 ID ID Taq 5 5 ID ID ID Taq 3 Lettura della fluorescenza 3 l l l ID ID ID ID ID Taq 5 Taq ID ID ID ID 3 l l

44 DNA amplificato (scala log) Come sono quantificati i dati raccolti dallo strumento? Teorico Reale Detector threshold Numero di ciclo Una volta determinata la linea di base (fluorescenza nei primi cicli di amplificazione), la linea di threshold viene scelta come il valore di fluorescenza che statisticamente supera la linea di base (10 volte la deviazione standard della linea di base).

45 Ct : threshold cycle E il ciclo al quale la fluorescenza relativa al DNA amplificato supera il valore della linea di threshold. Il Ct è proporzionale al numero di sequenze di DNA iniziali amplificate con la PCR.

46 Il Ct è proporzionale al numero di sequenze di DNA iniziali amplificate con la PCR. 4 unità Ct =23 1 unità Ct = 25 1/8 di unità Ct = 28 Valori di Ct 4 units Ct=

47 Ct : threshold cycle L uso di curve di taratura permette anche di determinare il valore assoluto di specifiche sequenze di DNA nel campione analizzato.

48 Che cosa è la Real-time PCR? Si basa sulla determinazione quantitativa e in tempo reale dei prodotti di amplificazione della PCR mediante l uso di molecole fluorescenti che si legano al DNA La Real-time PCR permette di quantificare i livelli di una specifica molecola di DNA misurando il numero di cicli (C t ) necessari per ottenere un quantitativo di prodotto amplificato superiore ad un determinato livello (threshold)

49 Applicazioni della Real-time PCR Quantificazione precisa di DNA o RNA in campioni Stima del numero di copie di un gene (OGM) Studi di espressione genica RNA (quantificazione del mrna)

50 Quantificazione dell espressione genica Tutte le cellule di un organismo contengono lo stesso DNA (e quindi le stesse informazioni o geni). Tuttavia non tutti i geni vengono egualmente espressi (diversità tra cellule) Ogni gene espresso viene convertito in mrna per poi essere tradotto in proteina Le differenti proteine prodotte in una cellula ne determinano le specifiche funzioni

51 E possibile quantificare i livelli di mrna di specifici geni mediante la Real-time PCR L mrna viene prima convertito in DNA (cdna) e poi sequenze specifiche (corrispondenti a determinati geni) vengono quantificate mediante la tecnica E così possibile identificare e quantificare geni che vengono diversamente espressi in determinate cellule o in seguito a modifiche (trasformazione tumorale)