Funghi micotossigeni e micotossine in campo e durante lo stoccaggio

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1 Riso Baby food: un mercato da riconquistare Funghi micotossigeni e micotossine in campo e durante lo stoccaggio Paola Giorni, Terenzio Bertuzzi Facoltà di Scienze Agrarie, Alimentari e Ambientali -Università Cattolica-Piacenza 07 Febbraio 2018 Castello d Agogna (PV)

2 Riso italiano: isola felice o mancanza di dati?

3 Funghi filamentosi Alcuni Generi sono in grado di produrre micotossine - Comunemente noti come «muffe» - Eucarioti, non contengono clorofilla, producono spore e strutture filamentose - Distribuzione ubiquitaria (suolo, acqua) - Aerobi obbligati o facoltativi - Saprofiti: decompongono il materiale organico non vitale in nutrienti inorganici solubili. - Delle oltre specie fungine, 250 circa sono patogene per l uomo.

4 I principali generi fungini micotossigeni Fusarium Aspergillus Penicillium Penicillium Fusarium Aspergillus

5 Aspergillus versicolor Fungini micotossigeni trovati sul riso Fusarium graminearum Aspergillus flavus Aspergillus sezione Nigri

6 Specie micotossigene Micotossine ASPERGILLUS: A. flavus; A. parasiticus aflatossine A. flavus acido ciclopiazonico A. ochraceus; Penicillium viridicatum; P. cyclopium ocratossine A. versicolor sterigmatocistina (STC) PENICILLUM: P. citrinum; P. expansum citrinina P. expansum patulina P. citreo-viride citroviridina FUSARIUM: F. culmorum; F. graminearum deossinivalenolo (DON) F. sporotrichioides; F. poae diacetossiscirpenolo (DAS) F. sporotrichioides; F. poae zearalenone (ZEN) F. culmorum; F. graminearum; F. sporotrichioides T-2 toxin F. moniliforme Fumonisine; moniliformina Babyrice Project

7 Possibili infezioni Aria Acqua Umidità In campo In post-raccolta Temperatura Aw Clima

8 Babyrice Project

9 Obiettivi del progetto: Verificare la presenza di funghi micotossigeni e relative micotossine in campo. Verificare la presenza e l andamento dei funghi micotossigeni e delle relative micotossine durante lo stoccaggio del riso.

10 SCHEMA PROVE IN CAMPO PROVA VARIETALE 9 varietà 3 località 5 tempi di prelievo Replica 2 Replica 3 Replica 1 PROVA DI DENSITA DI SEMINA 5 varietà 3 località 3 densità di semina 3 tempi di prelievo

11 Campionamenti fungini IN CAMPO IN POST- RACCOLTA Fioritura Maturazione cerosa Maturazione fisiologica Maturazione fisiologica +15gg

12 Risultati prova varietale Influenza delle diverse fasi di maturazione-infezione totale a b d c e

13 Risultati prova varietale % Influenza delle diverse varietà-infezione totale c cd a a a cd ab bc d 20 0

14 % Risultati prova varietale % % % Influenza delle diverse fasi di maturazione specie fungine micotossigene Fusarium spp. a 10 8 Aspergillus flavus 12 b c c 2 0 a b b b 10 8 Aspergillus versicolor 10 8 Aspergillus sezione Nigri b ab ab a a b b b

15 Risultati prova varietale Nessuna influenza significativa sulla presenza di funghi micotossigeni da parte di: - Epoca di maturazione - Altezza pianta - Tipo di granella

16 Risultati prova di densità di semina Differenze significative fra le diverse epoche di prelievo. In generale la raccolta risulta quella più contaminata per tutti i funghi, tranne che per A. versicolor che invece risulta più alto dopo 15 gg dall epoca di raccolta. 0 15gg pre-raccolta raccolta 15gg post-raccolta %FUS %FLAV % NIGER % VERSICOLOR % INF.TOT

17 Risultati prova di densità di semina Nessuna differenza significativa fra le 3 diverse densità di semina utilizzate %FUS %FLAV % NIGER % VERSICOLOR % INF.TOT

18 Schema prova in post-raccolta Prelievi di risone conservato con 2 diverse modalità: - Media refrigerazione (10-15 C) - Alta refrigerazione (1-2 C) Prelievi ogni 3 settimane da inizio conservazione fino ad un massimo di 6 mesi.

19 Risultati prova in post-raccolta % % Media refrigerazione Arborio CL15 Luna Selenio Vialone Nano Total Fusarium spp. A.versicolor XL Nel tempo, l infezione fungina totale tende a rimanere costante o, in alcuni casi, a decrescere. N.B.: riduzione di circa il 50% dell infezione fungina totale, riduzione totale di A. versicolor ma nessun effetto su Fusarium spp. Alta refrigerazione In post-raccolta, raramente si sono isolati ceppi di A. flavus, A. sezione Nigri o Penicillium spp Carnaroli Selenio Sole Total Fusarium spp. A.versicolor

20 Micotossine: (mycota + toxon) metaboliti secondari velenosi prodotti da alcuni funghi microscopici e muffe parassiti delle piante e/o delle derrate alimentari. Il termine metabolita secondario indica che ad oggi non gli è stato attribuito alcun significato nella crescita dell organismo che lo produce durante il suo ciclo vitale. Penicillum Aspergillus Babyrice Project

21 Cereali possono subire contaminazioni da micotossine. Principali micotossine in cereali coltivati in Italia: Mais: aflatossine, fumonisine, tricoteceni, zearalenone Frumento: tricoteceni (deossinivalenolo, DON), ocratossina A Riso: aflatossina, ocratossina A, sterigmatocistina Micotossine analizzate nel progetto: aflatossine, ocratossina A, deossinivalenolo (normate dalla Comunità Europea), sterigmatocistina. Babyrice Project

22 Reg. CE n. 165/2010 del 26/02/2010; Reg. CE n. 1881/2006 del19/12/2006 Granturco e riso da sottoporre a cernita o ad altro trattamento fisico prima del consumo umano Tutti i cereali e loro prodotti derivati per consumo umano AFB 1 ppb Σ AFs ppb OTA ppb DON ppb 5,0 10,0 5, (1750 per mais, fr. duro e avena) 2,0 4,0 3,0 750 Alimenti a base di cereali e altri alimenti destinati ai lattanti e ai bambini Alimenti dietetici a fini medici speciali destinati specificamente ai lattanti Pane, pasticceria, cereali per colazione 0,10 0, ,10 0, Babyrice Project

23 Babyrice Project

24 Babyrice Project

25 integrità fisica delle granaglie I tegumenti delle granaglie rendono più difficile l accesso del fungo alla parte amidacea dell endosperma. Le granaglie spezzate sono più suscettibili delle intere alla colonizzazione fungina: aumento delle superfici di contatto con il fungo mancanza della protezione esercita dai tegumenti esterni nei confronti della parte amidacea dell endosperma microambienti di conservazione All interno delle masse di granaglie in conservazione possono essere formarsi delle zone in cui il contenuto di umidità delle granaglie è tale da consentire lo sviluppo fungino e in alcuni casi la produzione delle micotossine cause: umidificazione accidentale formazione di zone di condensa Babyrice Project

26 Distribuzione dell aflatossina nei prodotti agricoli Generalmente, meno dello 0,1% dei baccelli o cariossidi sono contaminati Un singolo baccello di arachide è risultato contenere 1 milione di ng/g (ppb) Un singolo seme di cotone è risultato contenere 5 milioni di ng/g (ppb) Una singola cariosside di mais è risultata contenere 400 mila ng/g (ppb) E stato stimato che in una partita di mais contaminata a livello di 20 ng/g, solo 6 cariossidi su 10 mila sono contaminate Elevata disomogeneità, difficoltà di campionamento Babyrice Project

27 Metodi di analisi Dopo un corretto campionamento, l analisi delle micotossine in una matrice alimentare prevede: Preparazione del campione (macinazione, omogeneizzazione) Estrazione della(e) micotossina(e) con opportuna miscela Purificazione estratto Analisi quantitativa (lateral flow, ELISA, tecniche cromatografiche) La Comunità Europea n. 2002/657/EC definisce: 1) Metodi di screening (lateral flow, ELISA) i metodi usati per rilevare la presenza di una sostanza al livello di interesse ; tali metodi consentono di analizzare, in tempi brevi, un elevato numero di campioni al fine di verificarne la conformità o, come si dirà, la (sola) sospetta non conformità. 2) Metodi di conferma (tecniche cromatografiche) i metodi che forniscono informazioni complete o complementari atte ad identificare la sostanza in modo univoco e se necessario a quantificarla al livello di interesse [paragrafo 7 punto Allegato II Regolamento (UE) n. 519/2014]. Tali metodi consentono di accertare la presenza dell analita (cioè della sostanza ricercata) e la relativa concentrazione. Babyrice Project

28 Campioni di risone Risultati prove in campo 2017 Ocratossina A mai rilevata. Deossinivalenolo raramente e in tracce (valore massimo 36 ng/g; limite legge:1250 ng/g). Presenza di aflatossina B 1 (AFB 1 ) nel 52,8% dei campioni a livelli contenuti, valore massimo 2,45 ng/g (limite legge: 5 ng/g). Sterigmatocistina (STC) rilevata nel 97,2% dei campioni dopo la fioritura. AFB 1 e STC prodotte da diversi specie di Aspergillus. Estate 2017 caratterizzata da alte temperatura e siccità. Babyrice Project

29 AFLATOSSINA B1 Prova in campo campo 1 Varietà tipo lungo B. fioritura post fiorit Mat cerosa Mat fisiologica post racc Sirio < 0,01 0,02±0.03 0,06±0,10 0,07±0,06 0,44±0,50 Mare < 0,01 0,11±0,11 0,04±0,04 0,10±0,10 0,05±0,05 CL 26 < 0,01 0,80±0,83 0,13±0,11 0,14±0,14 0,19±0,20 CL XL < 0,01 0,13±0,10 0,04±0,06 0,06±0,05 0,97±1,31 Densità di semina Sirio 15 gg racc raccolta post racc 100 0,10±0,08 0,86±0,96 0,26±0, ,06±0,10 0,07±0,06 0,44±0, ,03±0,04 0,23±0,21 0,34±0,22 2,50 2,00 1,50 1,00 Sirio Mare CL 26 Mare 15 gg racc raccolta post racc 100 0,08±0,08 0,03±0,02 0,36±0, ,04±0,04 0,10±0,10 0,05±0, ,05±0,07 0,21±0,18 0,16±0,14 0,50 CL XL Dati in ng/g (ppb). 0,00-0,50 post fiorit mat cerosa mat fisiol post racc Babyrice Project

30 AFLATOSSINA B1 Prova in campo campo 2 Varietà tipo tondo. fioritura post fiorit Mat cerosa Mat fisiologica post racc Sole < 0,01 0,18±0.19 0,04±0,04 0,07±0,07 0,08±0,08 Selenio < 0,01 0,28±0,15 0,10±0,11 0,20±0,21 0,22±0,19 Terra < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 Centauro < 0,01 0,02±0,03 0,02±0,01 0,02±0,02 0,07±0,07 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00-0,05 post fiorit mat cerosa mat fisiol post racc Sole Selenio Terra Centauro Babyrice Project Densità di semina Sole 15 gg racc raccolta post racc 100 0,03±0,03 0,08±0,10 0,06±0, ,04±0,04 0,07±0,07 0,08±0, ,01±0,01 0,17±0,16 0,16±0,15 Selenio 15 gg racc raccolta post racc 100 0,01±0,01 0,23±0,26 0,20±0, ,10±0,11 0,20±0,21 0,22±0, ,15±0,13 0,12±0,11 0,23±0,26 Dati in ng/g (ppb). Campo 3 Varietà tipo tondo risultati simili

31 Ad oggi non normata; richiesta EFSA STERIGMATOCISTINA Prova in campo campo 1 Varietà tipo lungo B. diffusa presenza in riso e derivati European survey on sterigmatocystin in cereals, cereals-based products, beer and nuts, World Mycotoxin Journal, In cereal grains, rice and oats seemed the cereals most prone to STC contamination (100% unprocessed rice, 22% oats grains). In cereal products, levels were lower than in cereal grains. The highest incidence was in processed rice (21%) and breakfast cereals (19%) 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Sterigmatocistina - varietà post fiorit mat cerosa mat fisiol post racc Sirio Mare CL 26 CL XL Babyrice Project 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Sirio densità semina mat cerosa mat fisiol Mare densità semina mat cerosa mat fisiol post racc post racc d 100 d 150 d 200 d 100 d 150 d 200

32 Prova in campo campo 2. Varietà tipo tondo. -1,00 STERIGMATOCISTINA Prova in campo campo 3. Varietà tipo tondo. 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Sterigmatocistina - varietà post fiorit mat cerosa mat fisiol post racc Sterigmatocistina - varietà post fiorit mat cerosa mat fisiol post racc CL 15 Terra Selenio Centauro 3,00 2,00 1,00 0,00 Sole Selenio Terra Centauro 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 Centauro - densità semina mat cerosa mat fisiol post racc Babyrice Project 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0,00 mat cerosa mat fisiol post racc Sole - densità semina mat cerosa mat fisiol Selenio - densità semina d 100 d 150 d 200 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00-1,00 d 100 d 150 d 200 post racc mat cerosa mat fisiol post racc d 100 d 150 d 200 Selenio - densità semina d 100 d 150 d 200

33 Distribuzione AFB1 e STC in riso integrale e bianco Aflatossina B 1 Integrale Bianco <0,01 0,07 <0,01 <0,01 1,01 0,10 0,13 <0,01 1,06 0,11 <0,01 <0,01 0,04 <0,01 0,18 <0,01 0,10 <0,01 0,07 <0,01 0,03 <0,01 0,26 0,02 Sterigmatocistina Integrale Bianco 0,05 <0,05 0,12 <0,05 0,17 0,07 0,08 <0,05 0,12 0,06 0,07 <0,05 0,09 0,06 0,09 <0,05 0,09 <0,05 0,06 <0,05 0,37 0,10 0,07 <0,05 Limite per AFB 1 : 2,0 ng/g per uso umano 0,1 ng/g per baby food Babyrice Project

34 Stoccaggio Media refrigerazione (10-15 C) Alta refrigerazione (1-2 C) Per ogni micotossina considerata, non sono stati rilevati aumenti di contaminazione durante i due tipi di stoccaggio (5-6 mesi). DON presente a bassi livelli, OTA assente. Babyrice Project