Obiettivi della genomica
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- Aniella Filippi
- 5 anni fa
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1 Obiettivi della genomica Stabilire database ed interfaccie di ricerca per le analisi genomiche. Ottenere e combinare mappe fisiche e genetiche del genoma Generare ed ordinare sequenze genomiche e sequenze di geni espressi Identificare ed annotare tutti i geni codificati da un determinato genoma Costruire atlanti di espressione genica Accumulare dati funzionali ed integrarli ai dati genomici Caratterizzare la diversità di sequenza del DNA Fornire risorse per eseguire comparazioni tra genomi Le mappe genetiche Una mappa genica è la descrizione dell ordine relativo dei marcatori genetici nei gruppi di associazione (linkage) L unità standard è il cm, che esprime la percentuale della progenie in cui è avvenuto un evento di ricombinazione tra due marcatori.
2 Un cromosoma ha una lunghezza di circa 100 cm Due marcatori che si trovano su cromosomi diversi hanno una probabilità di segregare insieme del 50%. Due marcatori con distanza maggiore di 50 cm possono essere presenti nello stesso gruppo di linkage se sono associati ad un terzo marcatore che dista meno del 50% da ambedue Ricombinazione genomica La ricombinazione tende ad essere soppressa vicino al centromero ed incrementare notevolmente nelle parti distali del cromosoma con particolare riguardo per le ultime Mb. La ricombinazione è più alta in cromosomi corti per permettere almeno un crossing-over per braccio, anche perche i crossing-over sembrano essere necessari per la corretta disgiunzione meiotica delle coppie di cromosomi omologhi. 2
3 Ricombinazione genomica La ricombinazione media per cromosoma aumenta in funzione della riduzione della lunghezza del braccio del cromosoma. Lunghe braccia cromosomiche hanno una media di ricombinazione di un cm per Mb mentre braccia corte possono arrivare a 2 cm per Mb. La costruzione di mappe genetiche può essere fatta anche usando i radiation hybrid (RH). Cellule irradiate TK+ vengono fuse con cellule di criceto. La libreria è costituita da 100 o più linee cellulari Frammenti di cromosomi eterologhi vengono inseriti nei cromosomi di criceto Usando PCR specie-specifica è possibile definire quali loci sono presenti in un unica linea cellulare 3
4 Mappa fisica Un punto importante preliminare al sequenziamento del genoma umano è stata la costruzione di una mappa fisica ad alta risoluzione di ognuno dei cromosomi umani. Per completare una mappa fisica di 3 x 10 9 basi è necessario disporre di libraries genomiche comprensive di tutto il genoma suddiviso in frammenti sovrapposti e clonati in appositi vettori. Una delle caratteristiche di queste libraries genomiche è che devono essere costituite da grossi frammenti di DNA nell ordine di Kb in modo che con 2-5 x 10 5 cloni indipendenti è possibile avere la completa rappresentazione del genoma. 300 kb Eterocromatina costitutiva gaps BAC: Bacterial artificial chroosome Nel 1992 è stato sviluppato un vettore di clonaggio basato sul fattore episomale F di Escherichia coli. Il fattore F di E. coli è un DNA extracromosomale circolare che contiene sul suo DNA alcuni geni regolativi: oris e repe para e parb I vettori BAC sono caratterizzati da: un marcatore fenotipico siti cosn del batteriofago lambda e loxp del batteriofago P1 una serie di siti di restrizione rari.
5 BAC Fingerprint: Ordinamento dei cloni BAC
6 Il chromosome walking permette di costruire delle contig in modo sequenziale. Usando la sequenza terminale di un primo clone si identificano altri che la condividono. Usando l analisi dei profili di restrizione è possibile ricostruire consequenzialità dei vari cloni. Si isola una nuova sequenza terminale e si ripete la procedura. Dal punto di vista storico il metodo principale per allineare le mappe fisiche con le genetiche è l uso delle mappe citologiche. Le mappe citologiche sono profili di bandeggio cromosomico osservabili al microscopio ottico su piastre metafasiche colorate. L ibridazione in situ di frammenti di DNA (STS, sequence tagged site) permette l allineamento con la mappa fisica.
7 Mappatura citogenetica Bandeggiamento: C-banding D-banding G-banding N-banding T-banding Integrazione tra citogenetica e sequenze genomiche Il collegamento tra mappa citogenetica e sequenza nucleotidica è stato realizzato attraverso l uso delle STS (sequenze tagged site) che sono delle sequenze uniche del genoma. La definizione di una mappa fisica genomica di STS è stato uno dei passi preliminari al sequenziamento del genoma umano. Utilizzando una tecnica nota come FISH è stato possibile mappare la posizione di lunghi frammenti genomici ( kb), contenenti una o piu STS, sul cromosoma metafasico e di conseguenza associare la posizione delle STS all interno delle bande citogenetiche
8 FISH: Trisomia del 21 FISH Integrazione tra citogenetica e sequenze genomiche
9 Integrazione tra citogenetica e sequenze genomiche La sintenia si riferisce alla conservazione dell ordine dei geni tra segmenti cromosomici di due o più organismi. Il grado di sintenia tra genomi puo essere valutato anche in assenza delle sequenze complete dei due genomi usando una tecnica che si chiama chromosome painting. 9
10 Esempio di sintenia tra uomo e gatto. I 12 cromosomi nella parte alta della figura sono essenzialmente sintenici per tutta la lunghezza La fila inferiore è caratterizzata da almeno un riarrangiamento principale nei restanti 10 autosomi I cromosomi sessuali sono essenzialmente sintenici Per un approfondito studio della sintenia è necessario disporre delle sequenze dei genomi. Sintenia tra uomo e topo. La conservazione dell ordine dei geni e della sequenza di DNA è osservabile a tre livelli Stesso ordine per 23 geni in 5q3 (B) Alta conservazione delle sequenze più lunghe di 100 basi (c) 5q31
11 Paraloghi ed ortologhi Lo studio comparativo tra genomi è molto utile per definire la presenza di generali meccanismi di regolazione Per valutare l importanza della conservazione di una specifica funzione genica Parologhi: geni duplicati all interno dello stesso genoma Ortologhi: geni che svolgono la stessa funzione in specie diverse 11
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