trna-ribosoma Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

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1 trna-ribosoma Marco Nardini Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie Università di Milano

2 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA acidi nucleici = polinucleotidi (polimeri di nucleotidi) in cui un gruppo fosforico fa da ponte fra le posizioni 3 e 5 di due unità ribosio vicine - legame fosfodiestere (2 legami esteri con 2 unità ribosio) - gruppi fosforici acidi (a ph fisiologico gli acidi nucleici sono polianioni -estremità5 residuo con posizione C5 non impegnata con altro nucleotide -estremità3 residuo con posizione C3 libera

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4 Struttura Acidi Nucleici RNA, DNA - le proprietà fisiche del polimero variano rispetto al monomero e dipendono dalle dimensioni (es: carica, solubilità) - il polimero (formato da monomeri non identici) rispetto al monomero contiene una informazione relativa alla sequenza RNA nessuna regola sulla composizione nucleotidica DNA n A = T e n G = C (Regole di Chargaff) natura doppia elica del DNA - composizione in basi del DNA molto variabile tra organismi diversi Es: G + C dal 25% -75% (ma ~costante in specie correlate: es. 39% -46% nei mammiferi)

5 Acidi Nucleici: DNA e RNA

6 Struttura RNA - catene di DNA ad elica singola sono rare (materiale genetico virale) - l RNA si trova prevalentemente sotto forma di catena singola non in forma estesa ma in una strutture compatte catene di RNA a doppia elica in materiale genetico virale - una catena di RNA (identica al DNA a meno di U al posto di T e per la presenza di 2 -OH) può formare accoppiamenti di basi con una catena complementare di RNA o DNA - l accoppiamento di basi (G C e A U) avviene spesso intramolecolarmente il singolo filamento di RNA può ripiegarsi in modo che sequenze complementari di basi formino uno stelo con loop a singolo filamento (struttura a stelo e ansa o a forcina)

7 Struttura RNA - RNA a doppia elica non può assumere una conformazione simile al DNA B per interferenze steriche che coinvolgono i gruppi 2 -OH - conformazione simile al DNA A possibile elica destrorsa, passo dell elica 30.9 Å, nucl/giro 11.9, inclinazione basi/asse elica ~ doppie eliche ibride RNA-DNA: strutture tipo DNA A o intermedie fra DNA A e DNA B - corte doppie eliche ibride durante l inizio della replicazione del DNA e durante la trascrizione del RNA sul DNA 10-bp RNA DNA hybrid helix consisting of d(ggcgcccgaa) in complex with r(uucgggcgcc)

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9 Struttura RNA - la struttura del RNA è stabilizzata dalle stesse forze che stabilizzano il DNA - la flessibilità conformazionale dell RNA è limitata in modo analogo al DNA (può essere anche più rigido a causa delle interazioni con molecole di H 2 O dei suoi gruppi 2 -OH) - tuttavia l RNA ha forme e dimensioni maggiormente variabili rispetto al DNA - la potenziale complessità strutturale del RNA si riflette nel fatto che l RNA non mantiene e trasmette solo l informazione genetica ma può legare piccole molecole e catalizzare reazioni chimiche

10 Il mondo ad RNA Evidenze: - gli acidi nucleici possono dirigere la propria sintesi - nelle cellule esistono molti enzimi proteici in grado di interagire col DNA ma pochi con l RNA - molti coenzimi coinvolti in percorsi biosintetici e di immagazzinamento di energia sono ribonucleotidi (ATP, NAD +, FAD, CoA) - molecole di RNA hanno attività enzimatiche: ribozimi (es: catalisi della formazione del legame peptidico nei ribosomi) - nei virus a RNA (a singola o doppia catena) l informazione genetica è codificata dal RNA Ipotesi: in tempi pre-cellulari, gli RNA erano i catalizzatori biologici originali mondo ad RNA

11 Il mondo ad RNA Domande: 1) perché durante l evoluzione i catalizzatori proteici hanno sostituito i ribozimi? 2) perché il DNA ha sostituito l RNA per la codifica dell informazione genetica? Risposte: 1) i 20 aa contengono una varietà di gruppi funzionali (ossidrilici, sulfidrilici, ammidici, carbossilici) non presenti nel RNA 2) il DNA è più stabile del RNA perché l RNA è più suscettibile all idrolisi catalizzata da una base (il DNA non possiede il gruppo 2 -OH)

12 Traduzione e sintesi delle proteine - la sintesi proteica non è diretta immediatamente dal DNA perché, almeno negli eucarioti, DNA e ribosomi non sono mai in contatto - RNA è l intermediario fra DNA ed il sistema di sintesi delle proteine - 3 tipi principali di RNA rrna: RNA ribosomiale (2/3 della massa ribosomiale) trna: RNA di trasferimento (piccole molecole compatte che portano gli aa ai ribosomi per la sintesi proteica) mrna: RNA messaggero (la cui sequenza nucleotidica dirige la sintesi proteica) - altre specie di piccoli RNA coinvolti nella regolazione dell espressione genica e processamento dei trascritti di RNA - tutti gli RNA sono trascritti da stampi di DNA - la trascrizione del DNA in RNA viene eseguita dalle RNA polimerasi (RNAPs)

13 Traduzione e sintesi delle proteine - un mrna non riconosce direttamente un aa, ma lega in modo assolutamente specifico molecole di trna che trasportano uno specifico aa - il trna contiene una sequenza di 3 nucleotidi detta anticodone complementare ai codoni del mrna - durante la traduzione gli aa trasportati dal trna si uniscono tra loro nell ordine con cui gli anticodoni del trna si legano ai codoni del mrna sul ribosoma

14 trna - molecole adattatrici che trasportano aa legati da reazioni enzimatiche specifiche - molecole formate da nucleotidi (18-28 kd). La maggior parte contiene 76 nucleotidi - struttura secondaria a trifoglio con proprietà comuni 1) gruppo fosforico all estremità 5 2) stelo accettore o stelo dell amminoacido stelo di 7 bp che comprende il nucleotide 5 -terminale l aa trasportato è legato al gruppo OH 3 terminale 3) braccio D (insieme stelo + ansa) stelo di 3-4 bp che termina con un ansa di 5-7 basi spesso contenente il residuo modificato diidrouridina (D) 4) braccio dell anticodone stelo di 5 bp che termina con l ansa che contiene l anticodone

15 Struttura terziaria del trna 5) braccio TψC (o braccio T) stelo di 5 bp che termina con l ansa che contiene la sequenza TΨC (Ψ pseudouridina) 6) sequenza 3 CCA con il gruppo ossidrilico 3 libero (a seconda della specie la sequenza -CCA può essere determinata geneticamente o aggiunta enzimaticamente ad un trna immaturo) - presenza nei trna di un alto numero ( 25%) di basi modificate dopo la trascrizione (80 diverse modificazioni trovate in 60 posizioni diverse del trna) (a) nessuna modificazione è essenziale per mantenere l integrità strutturale dei trna e per il legame coi ribosomi (b) le basi modificate possono partecipare al legame dell aa con lo stelo accettore e rinforzare le interazioni codone-anticodone

16 Struttura terziaria del trna Le molecole di trna hanno forma a L in cui lo stelo accettore e lo stelo T formano un braccio della lettera e lo stelo D e dell anticodone l altro braccio - i bracci sono entrambi lunghi ~60 Å - l anticodone ed il sito accettore dell aa sono alle estremità opposte della molecola (~75Å) - spessore relativamente piccolo (~20-25 Å) essenziale per la funzione biologica, poiché durante la sintesi proteica 2 trna si legano simultaneamente a codoni adiacenti sul mrna - la struttura terziaria è stabilizzata da interazioni derivanti dall esteso impilamento ed appaiamento delle basi all interno e tra gli steli elicoidali - di solito le basi coinvolte nelle interazioni trasversali sono invarianti (no W&C) tutti gli trna hanno struttura simile

17 Amminoacilazione del trna amminoacil-trna sintetasi (aars) legame di uno specifico aa all ossidrile 3 terminale del ribosio del trna formando un amminoacil-trna 2 reazioni: a) attivazione dell amminoacido mediante una reazione con ATP a formare un amminoacil-adenilato (amminoacil-amp) b) l amminoacil-amp reagisce con trna per formare l amminoacil-trna amminoacil-amp + trna amminoacil-trna + AMP Reazione completa: amminoacido + ATP + trna amminoacil-trna + AMP + PP i portata a compimento dall idrolisi di PP i generato nella prima fase della reazione

18 Ribosomi - piccoli organelli sito della sintesi proteica - grandi dimensioni (~ D nei batteri e D negli eucarioti) - grande complessità (dozzine di proteine differenti e parecchie grandi molecole di RNA)

19 funzioni vitali del ribosoma: Ribosomi 1) lega l mrna in modo che i suoi codoni siano letti con alta fedeltà 2) contiene siti di legame specifici per le molecole di trna (l amminoacil-trna entrante, il peptidil-trna che ha legato a sé la catena proteica nascente, il trna che ha donato il suo gruppo amminoacilico) 3) favorisce le interazioni fra fattori proteici non-ribosomiali necessari per iniziare la catena polipeptidica, per allungarla e per terminarla 4) catalizza la formazione del legame peptidico fra il peptidil-trna e l amminoacil-trna entrante 5) è in grado di traslocare l mrna ed il peptidil-trna con la catena nascente in modo da leggere in modo sequenziale i codoni

20 Struttura del Ribosoma nei procarioti - componenti ribosomiali descritti in termini della loro velocità di sedimentazione (in Svedbergs) in ultracentrifuga (che correla ~ con le loro dimensioni) - il ribosoma di E.coli intatto ha coefficiente di sedimentazione 70S e può essere dissociato in 2 subunità diverse fra loro : 1) subunità più piccola, 30S: una molecola di rrna 16S e 21 proteine diverse 2) subunità più grande, 50S: 2 molecole di rrna (5S e 23S) e 31 proteine diverse - convenzione: le proteine della subunità più piccola indicate con S, quelle della subunità più grande L, seguite da un numero (che ~ aumenta dalla più grande alla più piccola) - proteine di aa, tutte in copia singola tranne L12 (4 copie), con poche omologie di sequenza, ma alto numero di residui basici e pochi residui aromatici - i circa ribosomi in una cellula di E.coli rappresentano ~80% del suo RNA totale ed il 10% delle proteine

21 Struttura del Ribosoma nei procarioti numero delle proteine identifica la loro posizione in una gel elettroforesi bidimensionale a partire dall alto a sinistra per arrivare in basso a destra

22 Struttura del Ribosoma ribosoma

23 Struttura del Ribosoma nei procarioti Struttura secondaria 16S rrna (1542 nucleotidi) - formato da 4 domini con 54% delle basi appaiate - steli a doppia elica corti (<8 bp) e molti imperfetti 5S rrna (120 nucleotidi) 2/3 delle basi sono accoppiate 23S rrna (2904 nucleotidi) formato da 6 domini estesa struttura secondaria

24 Struttura del Ribosoma nei procarioti Struttura tridimensionale - prime strutture a bassa risoluzione con tecniche di microscopia elettronica e crioelettronica (cryo-em) - struttura cristallografica (2.4 Å) della subunità 50S del batterio alofilico Haloarcula marismortui (~10 6 atomi) - struttura cristallografica (~3.0 Å) della subunità 30S del batterio T. thermophilus - struttura cristallografica dell intero ribosoma 70S di T. thermophilus ed E.coli struttura caratterizzata da numerosi lobi e rigonfiamenti ed attraversata da canali e tunnel struttura prevalentemente determinata dalla componente ad RNA e non da quella proteica

25 Struttura del Ribosoma nei procarioti 1) subunità 16S e 23S formate da elementi elicali connessi da loops (spesso estensioni irregolari di eliche) Strutture stabilizzate da interazioni tra eliche: - impaccamento scanalatura minore - scanalatura minore - inserimento di gruppi fosfato nella scanalatura minore - inserimento di adenine conservate nelle scanalature minori 2) 16S: 4 domini distinti i domini della subunità 30S si possono 23S: 6 domini interconnessi muovere uno rispetto all altro, mentre la subunità 50S appare rigida

26 Struttura del Ribosoma nei procarioti 3) la distribuzione delle proteine nelle 2 subunità non è uniforme - la maggior parte delle proteine sono presenti nella faccia posteriore o ai lati - le zone all interfaccia di entrambe le subunità sono povere di proteine, specialmente le regioni che legano l mrna ed i trna 4) molte proteine consistono di un dominio globulare e di una coda - se presente, il dominio globulare è localizzato sulla superficie della subunità - la coda è priva di struttura secondaria, ricca di residui basici e si inserisce tra le eliche di RNA infiltrandosi all interno della subunità

27 Struttura del Ribosoma nei procarioti - interazioni mediante ponti salini tra catene laterali code proteiche (+) ed atomi di ossigeno dei gruppi fosfati dell RNA (-) neutralizzazione delle interazioni repulsive carica-carica fra segmenti di RNA vicini - sequenze delle code proteiche meglio conservate rispetto ai domini globulari ipotesi di un ribosoma primordiale interamente ad RNA. Le proteine eventualmente acquisite per stabilizzare la sua struttura e modulare la sua funzione

28 Struttura del Ribosoma nei procarioti - nella struttura del ribosoma completo le subunità 30S e 50S mantengono la stessa struttura che hanno quando isolate - 12 posizioni di contatto (RNA-RNA, proteina-proteina, RNA-proteina) fra le 2 subunità (molte interazioni mediate da ioni Mg 2+ ) - alcune interazioni di contatto devono essere rotte e riformate per permettere al ribosoma di funzionare il ribosoma ha 3 siti di legame distinti per il trna sito A: sito dell amminoacile che ospita l amminoacil-trna entrante sito P: sito del peptidile che ospita il peptidil-trna a cui la catena polipeptidica è attaccata sito E: sito di uscita che ospita il trna deacilato che deve uscire dal ribosoma

29 Struttura del Ribosoma nei procarioti i 3 trna si legano al ribosoma tutti nello stesso modo: - la subunità 30S lega le parti contenenti l anticodone - la subunità 50S lega la porzione rimanente - le interazioni consistono primariamente di contatti RNA-RNA e coinvolgono i segmenti di trna universalmente conservati il ribosoma lega allo stesso modo diverse specie di trna 50S 30S grigio: RNA magenta: segmenti di RNA che partecipano a contatti intersubunità blu: proteine giallo: segmenti di proteina che partecipano a contatti intersubunità E P A A P E

30 Struttura del Ribosoma nei procarioti - i 3 trna legati hanno struttura leggermente diversa col trna nel sito A simile al trna Phe ed il trna nel sito E distorto - la catena polipeptidica nascente occupa un tunnel nella subunità 50S che si estende dal sito P alla superficie (100 Å, ~ 15 Å di diametro) formato da residui prevalentemente idrofobici largo a malapena per contenere una α-elica. E poco probabile che il folding avvenga prima che la catena aa esca dal ribosoma

31 Traduzione e sintesi delle proteine Traduzione (punti fondamentali) 1) la sintesi della catena polipeptidica procede dal N-terminale al C-terminale l attività peptidil transferasica appende un aa al C-terminale della catena in crescita 2) l elongazione della catena polipeptidica avviene legando l ultimo residuo della catena crescente legato al trna presente nel sito P all aa legato al trna presente nel sito A la catena nascente viene quindi trasferita sul sito A lasciando nel sito P un trna scarico traslocazione della catena nascente al sito P e del trna scarico al sito E dove poi si dissocia dal ribosoma

32 Traduzione e sintesi delle proteine Traduzione (punti fondamentali) 3) i ribosomi leggono l mrna nella direzione 5 3 poiché l mrna viene anch esso sintetizzato nella direzione 5 3 nei procarioti i ribosomi possono iniziare la traduzione appena l mrna in fase di sintesi emerge dalla RNA polimerasi negli eucarioti ciò non accade perché la membrana nucleare separa il sito di trascrizione (nucleo) dal sito di traduzione (citosol) 4) la traduzione avviene su poliribosomi (o polisomi) nei procarioti ed eucarioti più di un ribosoma si lega ad una singola catena di mrna (singoli ribosomi separati da intervalli di Å) una volta che un ribosoma attivo ha lasciato libero il sito di inizio di della traduzione, un secondo ribosoma può accedere a quel sito e iniziare la sintesi 0.1 μm

33 Struttura del Ribosoma negli eucarioti - struttura e funzione simile a quella dei procarioti - differenza in molti dettagli a) massa D (vs D nei procarioti) e coefficiente di sedimentazione 80S b) 2 subunità diverse: 40S (leggera, 33 polipeptidi unici e 18S rrna) 60S (pesante, 49 polipepdtidi diversi e 3 rrna, 28S, 5.8S e 5S) - rrna eucariotici 18S e 28S simili in struttura secondaria ai procariotici 16S e 23S (le sequenze nucleotidiche sono meno conservate) - rrna 5.8S presente nella subunità pesante forma un complesso per appaiamento di basi con l rrna 28S - rrna 5.8S ha sequenza omologa all estremità 5 dell rrna 23S dei procarioti derivazioni da mutazioni che hanno alterato il processo di mutazioni posttrascrizionali dell rrna 23S portando alla formazione di un 4 rrna

34 Struttura del Ribosoma negli eucarioti - differenze rispetto ai procarioti associate alle parti aggiuntive, ma anche le parti comuni possono avere strutture leggermente diverse - 16 interazioni intersubunità, 12 delle quali corrispondono alle 12 trovate negli procarioti importante conservazione evolutiva Complessità addizionale probabilmente dovuta al fatto di ribosoma di lievito: crio-em, risoluzione di 15 Å - dover passare dal nucleo (dove si forma) al citoplasma (dove avviene la traduzione) - ha un meccanismo di inizio della traduzione più complesso - il macchinario con cui partecipa al percorso secretorio è più complicato

35 Autocostruzione subunità ribosomiali - le prime tappe nella costruzione delle subunità ribosomiali sono indipendenti dal legame di alcune proteine all rrna 16S il complesso che si genera costituisce la struttura portante a cui si associano le altre proteine - similmente per la subunità pesante - l autocostruzione in vivo dei ribosomi richiede la presenza di rrna e proteina in quantità appropriate espressione coordinata di rrna e proteine - nelle cellule eucariotiche è richiesto anche il trasporto nel nucleo delle proteine ribosomiali prodotte nel citosol - le cellule regolano la concentrazione dei ribosomi sulla base della velocità a cui devono sintetizzare le loro proteine nelle condizioni di crescita -in E.coli meccanismo di risposta stringente

36 Autocostruzione subunità ribosomiali -in E.coli meccanismo di regolazione mediante risposta stringente meccanismo che agisce quando uno qualsiasi dei trna carichi viene a limitare la velocità di sintesi proteica (che determina una condizione di crescita rallentata o stringente ) - un ribosoma lega un trna scarico segnala la carenza dell aa stimolando la proteina fattore stringente a catalizzare la sintesi del nucleotide (insolito) ppgpp ATP + GDP AMP + ppgpp ppgpp agisce come messaggero cellulare - riduce di volte la velocità di trascrizione dei geni per gli rrna e trna - stimola la trascrizione dei geni coinvolti nella biosintesi degli aa - reprime la trascrizione dei geni coinvolti nella replicazione del DNA e biosintesi dei carboidrati ppgpp potrebbe agire alterando la specificità del promotore della RNA polimerasi (essendo ppgpp capace di attivare o reprimere la trascrizione genica)