PCR. (Reazione a catena della polimerasi) ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO. Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani,

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1 PCR (Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani, ESERCITAZIONE DI LAB. N.2

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4 La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica che ha rivoluzionato il mondo della chimica e della genetica, permettendo l amplificazione in vitro di frammenti di DNA con innumerevoli applicazioni in campo medico, agrario, animale e nelle investigazioni della magistratura.

5 Polymerase Chain Reaction E essenzialmente una tecnica di amplificazione del DNA Ingredienti di base : DNA polimerasi termoresistenti e optimum di T 70 C Oligonucleotidi che fungono da innesco nt e 50-60% GC dntp DNA stampo Mg 2+

6 Non è indispensabile conoscere la sequenza intera PERCHE?

7 Basta conoscere le estremità del frammento di DNA da amplificare GATTCC CTAAGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG Disegnare oligonucleotidi (frammenti di DNA) a singola elica complementari ad una delle due estremità TTCGGG AAGCCC TTCGGG GATTCC

8 PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI: 1- DENATURAZIONE: TEMP. 95 C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO 2-APPAIAMENTO: TEMP C. I PRIMER SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO 3- SINTESI: TEMP.72 C E OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

9 Denaturazione del DNA GATTCC AAGCCC CTAAGG TTCGGG Rinaturazione del DNA GATTCC GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG TTCGGG Estensione Taq POLIMERASI 72 C

10 Estensione Taq POLIMERASI 72 C GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG

11 Denaturazione GATTCC CTAAGG Estensione Taq POLIMERASI 72 C AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG GATTCC CTAAGG AAGCCC TTCGGG

12 PCR DNA stampo Primer C per C (5 C < T m primer) CICLO 1 72 C CICLO 2 CICLO 3

13 Animazione PCR: Pcr.exe

14 Nella provetta è presente una sola copia del gene X Nella provetta sono adesso presenti miliardi di copie del gene X PCR dopo circa 3 ore gene X gene X Il gene X è stato amplificato

15 ESPERIMENTO DI CONTROLLO Nella provetta non è presente il gene X Nella provetta non è presente il gene X PCR dopo circa 3 ore Il gene X non è stato amplificato

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18 ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO - + Controllo negativo Marker

19 TIPICA MISCELA DI REAZIONE 20 µl l in una provetta micro Eppendorf (0.2 o 0.5 ml) COMPONENTE VOLUME Concentrazione finale H 2 O (a 20µl di volume finale) 12 µl 10 X PCR Buffer MgCl2 Forward primer (20 pmols/µl) 2 µl 1X 0,6 µl 1.5 mm 0,6 µl 0.6 µm Reverse primer (20 pmols/µl) 0,6 µl 0.6 µm 10 X dntps (2mM) 2 µl 0,25 mm polimerasi termostabile (5U/µl) 0.2µl 1 unità

20 Purificazione del 16S rdna da gel

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22 ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Procedura: Pesare un tubo eppendorf vuoto e segnare il risultato. Tagliare con un bisturi il frammento di DNA che interessa dal gel d agarosio. Durante questa fase è opportuno tagliare quanto più vicino al frammento in modo tale da prelevare la minima quantità di gel insieme al DNA di interesse. Porre la fetta di gel nel tubo eppendorf precedentemente pesato e pesare nuovamente il tutto. Segnare il risultato e calcolare il peso della fetta. Campione Peso eppendorf Peso epp+fetta Tara V QG DNA [ng/µl]

23 Procedura: Aggiungere 3 volumi del buffer QG ad 1 volume di gel (100 mg 100 μl). Es: aggiungere 300 μl di buffer QG per un frammento di 100 mg. IL Buffer QG contiene delle sostanze capaci di sciogliere l agarosio permettendo così la liberazione del DNA dalle maglie del gel stesso. Incubare per 10 minuti a 50 C. I tempi di incubazione possono essere aumentati per la completa dissoluzione del gel; per facilitare lo scioglimento vortexare, ogni 3 minuti, il tubo eppendorf (3-4 volte). Trasferire la soluzione nella colonnina fornita dal Kit; essa contiene una membrana che ha grande affinità per il DNA. Centrifugare per 1 minuto a rpm; in questo modo, durante la centrifugazione, il DNA si lega alla membrana della colonnina, mentre il resto attaversa la colonnina e si deposita sul fondo del tubo di plastica. Eliminare quindi l eluato e riporre la colonnina nel tubo di plastica.

24 Procedura: Aggiungere 750 μl del buffer PE. Incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio serve essenzialmente ad operare un lavaggio della colonnina permettendo l eliminazione delle scorie residue e lasciando il DNA adeso alla membrana della colonnina stessa. Centifugare per 1 minuto a rpm. Eliminare quindi l eluato e riporre la colonnina nel tubo di plastica. Centrifugare ancora una volta per 1 minuto a rpm. Questo passaggio permette di eliminare tutti i residui di etanolo. Eliminare l eluato e porre la colonnina in un tubo eppendorf da 1.5 ml. Aggiungere 50 μl del buffer BE (Tris-HCl 10 mm ph 8.5) al centro della membrana. Fare attenzione a non toccare la membrana con la punta. Il tampone BE permette di staccare il DNA dalla colonnina. Centrifugare 1 minuto a rpm. L eluato presente nell eppendorf contiene il DNA e va quindi conservato I prodotti di amplificazione purificati sono visualizzati e quantificati successivamente mediante elettroforesi su gel di agarosio.