ERSA - Agenzia regionale per lo sviluppo rurale Servizio ricerca e sperimentazione Pozzuolo del Friuli

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1 ANALISI OGM SOYA Il progetto si proponeva di verificare le caratteristiche qualitative di diversi lotti di soya rispetto alla contaminazione accidentale da OGM per avere una valutazione indicativa della situazione esistente sul mercato italiano. La legislazione in vigore nel nostro paese prevede, ai sensi del D.M. 27 novembre 2003 del MiPAF, per la certificazione della semente, l esecuzione di un analisi quantitativa tramite PCR su un campione di 3000 semi e, di fatto, autorizza la commercializzazione dei lotti aventi una percentuale di contaminazione accidentale da OGM inferiore allo 0,05%. Invece, per la valutazione delle 35 varietà oggetto di prova, è stato predisposto un campionamento variabile da 2 a 5 gruppi di 3000 semi in funzione dei risultati ottenuti progressivamente nel corso dell attività analitica. Ai fini dell attività sperimentale sono state eseguite prevalentemente analisi PCR qualitative mediante tecnica Real Time utilizzando i metodi validati previsti dalla UE. Con questo tipo di approccio è stato possibile stimare la contaminazione accidentale da OGM ricorrendo all applicazione di una elaborazione statistica basata sull analisi a gruppi su un campione di semente di dimensioni maggiori ( semi ) rispetto a quelle previste dai protocolli ufficiali (300 semi). L aumento delle dimensioni del campione permette inoltre di avere maggiori garanzie rispetto alla probabilità di avere una risposta positiva nel controllo di un lotto effettivamente contaminato. Infatti, un campione di 3000 semi consente di avere un risultato affidabile al 95% solo se la contaminazione reale è pari allo 0,1%. Viceversa, una campione di semi permette di avere gli stessi risultati in termini di affidabilità con una contaminazione reale del lotto pari allo 0,02%. Complessivamente sono state eseguite 1097 analisi PCR su 143 campioni per la determinazione del gene endogeno di riferimento, del promotore 35S e del transgene Roundup Ready che è risultato essere l unico OGM contaminante in tutte le varietà di soya. 4

2 I risultati ottenuti sono presentati sinteticamente nella tabella sottostante: Numero Varietà Y N n P% Li(%) Ls(%) PCR Quantitativa 1 Aires ,000 0,000 0,031 2 Ales ,014 0,002 0,058 3 Ascasubi ,000 0,000 0,031 4 Atlantic ,000 0,000 0,031 5 Blanca ,000 0,000 0,031 6 Brillante ,000 0,000 0,031 7 Colorado ,000 0,000 0,031 8 Cresir ,023 0,003 0,086 9 Dekabig ,000 0,000 0, Demetra ,000 0,000 0, Fiume ,000 0,000 0, Fukui ,000 0,000 0, Giulietta ,014 0,002 0, Goriziana ,000 0,000 0, Hilario ,000 0,000 0, Lory ,023 0,003 0, Magnum ,023 0,003 0, Nikir ,014 0,002 0, Nikko ,000 0,000 0, Pacific ,023 0,003 0, Pedro ,000 0,000 0, PR91B , ,038% 23 PR91M , ,084% 24 PR92B , ,062% 25 REGIR ,007 0,001 0, Safrana ,000 0,000 0, Sakai ,007 0,001 0, Sake ,000 0,000 0, Sapporo ,000 0,000 0, Sarema ,000 0,000 0, Sekoia ,000 0,000 0, Shama ,000 0,000 0, Sponsor ,000 0,000 0, Taira ,014 0,002 0, Zen ,023 0,003 0,086 Y = numero dei gruppi negativi N = numero dei gruppi saggiati n = numero di semi per ogni gruppo P % = percentuale di contaminazione da OGM Li % e Ls % = limite inferiore e limite superiore di contaminazione da OGM PCR quantitativa = percentuale di contaminazione da OGM misurata ai sensi del D.M. 27/11/2003 5

3 Il grafico sottostante mostra la ripartizione dei lotti di soya oggetto della prova rispetto alla soglia tecnica di tolleranza pari allo 0,05% prevista dalla normativa italiana. Complessivamente, il 94% dei campioni è risultato a norma e il 60% non ha mai presentato alcuna contaminazione da OGM in nessuno dei sub-campioni analizzati. 6% 34% 60% Negativi < 0,05% > 0,05% L attività sperimentale di controllo proseguirà con le stesse modalità di campionamento del seme per verificare la qualità delle produzioni ottenute rispetto al rischio di contaminazione derivante dalla coltivazione congiunta di partite contaminate e non nei campi sperimentali di confronto varietale allestiti in Friuli Venezia Giulia. 6

4 FRAGMENT ANALYSIS SOYA: Il progetto si proponeva di verificare ed individuare, attraverso una sperimentazione mirata anche alla messa a punto dei protocolli sperimentali più idonei, i migliori marcatori per l identificazione dei genotipi a bassi fattori antinutrizionali mediante lo screening in PCR dei microsatelliti attualmente disponibili. In considerazione dei risultati ottenuti in precedenti lavori sperimentali finalizzati all identificazione varietale ( Bommi and Ferguson - Soybean cultivar identification within a selected group using only an agarose gel system with simple sequenze repeats DNA markers) è stato inizialmente selezionato un pool di 5 microsatelliti che sono stati saggiati direttamente tramite un sequenziatore ABI PRISM 310 Genetic Analyzer a singolo capillare secondo i seguenti protocolli sperimentali: 1) estrazione DNA da semente di diverse varietà di soia con metodo CTAB/ silice- magnetite. Determinazione della concentrazione del DNA estratto attraverso lettura allo spettrofotometro e diluizione finale alla concentrazione di 20 ng/µl. 2) PCR qualitativa con primers fluoresceinati ( primer FOR marcato in posizione 5 ); microsatelliti saggiati: Satt 005, Satt 173, Satt 181, Satt 185 e SYHSP 176. Taratura di protocolli PCR fino alla individuazione delle specifiche ottimali per ogni marcatore: SATT 005 Ciclo 1: 95 C x 10 Ciclo 2: 95 C x 1 47 C x 1 72 C x 1 (x 40 ) Ciclo 3: 72 C x 45 Ciclo 4: 16 C x SATT 173 e SYHSP 176 Ciclo 1: 95 C x 10 Ciclo 2: 95 C x 1 51 C x 1 72 C x 1 (x 40 ) Ciclo 3: 72 C x 45 Ciclo 4: 16 C x SATT 181 e SATT 185 Ciclo 1: 95 C x 10 Ciclo 2: 95 C x 1 55 C x 1 72 C x 1 (x 40 ) Ciclo 3: 72 C x 45 Ciclo 4: 16 C x 7

5 Mix PCR Materiali Tipo Unità di misura Concentrazione finale PCRbuffer Applera X 1 MgCl2 Applera millim 2 dntps Sigma microm 200 Taq polimerasi Applera U/microlitro 0,75 U/reazione acqua Quanto necessario Volume mix per ogni campione = 20 µl Volume DNA campione con una concentrazione iniziale di 20 ng/ µl = 5 µl. Volume totale PCR = 25 µl Nella tabella di seguito riportata sono indicati per ogni microsatellite: 1. il tipo di fluoroforo associato, 2. la concentrazione finale dei primers utilizzati nelle mix PCR. Microsatellite fluoroforo Concentrazione finale primers satt 005 FAM 0.5 microm satt 173 PET 0.1 microm satt 181 VIC 0.1 microm satt 185 NED 0.1 microm SYHSP 176 FAM 0.5 microm 3) Eseguita la Fragment analysis su tutti i campioni per i 5 diversi microsatelliti. I prodotti PCR sono stati provati diluiti a diverse concentrazioni per poter ottenere una fluorescenza con valori di RFU compresi tra 200 e In tabella sono riportate le diluizioni ottimali per ogni microsatellite. Microsatellite Diluizione prodotto PCR satt 181 1: 10 satt 185 1: 10 SYHSP 176 1: 40 satt 005 1: 10 satt 173 1: 30 Procedimento per il caricamento : Per ogni campione sono stati aggiunti 10 µl di Formammide, 0,2 µl di Marker (Gene Scan-500LIZ SizeStandard) ed 1 µl del campione PCR diluito. 8

6 Denaturazione dei campioni a 95 C per 5 minuti nel termociclatore Bio Rad qualitativo, ghiaccio per 2 minuti. Per la gestione e l elaborazione dei dati sono stati utilizzati i seguenti programmi: 310 DATA COLLETION (per gestire le corse di elettroforesi dello strumento) e GENE MAPPER per elaborare il profilo dei marcatori molecolari. RISULTATI: DIMENSIONI E VARIABILITA DEGLI ALLELI TROVATI Satt bp Satt 173: bp (198 bp, 199 bp, 210 bp, 224 bp, 243 bp, 248 bp) Satt 181: bp (175 bp, 205 bp, 214 bp) Satt 185: bp (206 bp, 224 bp, 227 bp, 245 bp, 248 bp, 251 bp, 254 bp) SYHSP 176: bp (103 bp, 111 bp, 113 bp, 123 bp) Il satt 005 non ha discriminato le varietà oggetto di studio in quanto ha individuato un unico allele uguale per tutte. Di seguito sono presentate alcune immagini di esempio di diverse corse elettroforetiche : SATT 181 SATT 185 9

7 HYSP

8 TABELLA RIEPILOGATIVA DEGLI ALLELI DETERMINATI CON I MICROSATELLITI SATT 005, SATT 173, SATT 181, SATT 185, SYHSP 176: VARIETA' Satt 005 Satt 173 SYHSP 176 Satt181 Satt 185 AIRES ALES ASCASUBI ATLANTIC BLANCA BRILLANTE COLORADO CRESIR DEKABIG DEMETRA FIUME30S FUKUI GIULIETTA GORIZIANA HILARIO LORY MAGNUM NIKIR NIKKO PACIFIC PEDRO PR91B PR91M REGIR SAFRANA SAKAI SAKE /227 SAPPORO SAREMA SEKOIA SHAMA SPONSOR TAIRA ZEN

9 I risultati ottenuti sono parziali e consentono di discriminare solo alcune varietà. Per questo motivo il lavoro è proseguito con un attività di screening che riguarderà la valutazione tramite PCR qualitativa di oltre 80 microsatelliti selezionati da un database pubblico disponibile sul web. Lo screening preliminare è iniziato dalle seguenti coppie di primers SATT: 001, 009, 020, 022, 031, 045, 072, 129, 141, 143, 152, 153, perché presentanti la stessa T di Annealing. Per ogni combinazione sono stati utilizzati preliminarmente 8 campioni ( 7 campioni di soia + un controllo negativo (acqua)). Materiale utilizzato: DNA ottenuto da campioni di soia varietà: PACIFIC, ATLANTIC, DEMETRA, SAFRANA, SAKE, DEKABIG, REGIR. Metodo di estrazione del DNA:CTAB- SILICE MAGNETITE. PCR: mix materiali tipo Unità di misura Concentrazione finale PCRbuffer Applera X 1 MgCl2 Applera millim 2 dntps Sigma microm 200 Primer for Satt microm 0.2 Primer rev Satt microm 0.2 Taq polimerasi Applera U/microlitro 0,75 U/reazione acqua q.b. Volume mix per ogni campione = 20 µl Volume DNA campione con una concentrazione iniziale di 20 ng/ µl = 5 µl. Volume totale PCR = 25 µl Condizioni PCR: Ciclo1: (1X) step1 95 C per 10 minuti Ciclo 2: (40X) step 1 95 C per 30 secondi step 2 54 C per 30 secondi step 3 72 C per 30 secondi 12

10 Gel PCR. I prodotti della PCR sono stati visualizzati su GEL di agarosio al 2% in tampone TBE 1X, con colorante SYBR Green, facendo correre i campioni a 100 W per un tempo approssimativo di mezzora. Il marker utilizzato è stato: Fermentas 50 bp. Esempio di PCR qualitativa su microsatelliti Satt 009 (fila inferiore) e Satt 031 (riga superiore) A conclusione del lavoro di screening saranno individuati i marcatori caratterizzati dalla maggiore variabilità e su questi inizierà l attività sperimentale per la messa a punto dei protocolli da applicare nella fragment analysis su Sequenziatore a capillare ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. - Pozzuolo del Friuli, 22 novembre 2006 Il sostituto direttore del dell ERSA Dott. Francesco Del Zan 13