Sviluppo e convalida di un metodo analitico
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- Carolina Graziani
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1 Sviluppo e convalida di un metodo analitico
2 Sviluppo del metodo analitico Esistono molteplici ragioni per lo sviluppo di un nuovo metodo analitico tra cui: mancanza di un metodo per l analisi di un determinato analita in una specifica matrice; i metodi esistenti non soddisfano in termine di precisione, accuratezza sensibilità e/o selettività: i metodi esistenti possono essere troppo costosi in termini economici e di tempo o non sono automatizzabili; esigenza di un metodo supplementare per confermare i dati esistenti ottenuti con il metodo tradizionale.
3 1. Scelta del metodo strumentale Lo sviluppo di un nuovo metodo analitico inizia dalla ricerca bibliografica mediante banche dati elettroniche (PubMed, Scifinder, ecc). Si cerca di mirare il più possibile la ricerca bibliografica fornendo il maggiore numero di parametri tra cui lo strumento analitico da utilizzare che a sua volta viene scelto sulla base della struttura dell analita, della sensibilità desiderata e della matrice in cui è presente l analita. Per questo è quindi necessario scegliere, in primo luogo, il metodo strumentale ottimale, sulla base della struttura, caratteristiche chimico fisiche dell analita e la matrice da analizzare. Si supponga, per esempio, di voler analizzare del desametasone acetato: Il metodo secondo Farmacopea Europea prevede l uso dell UV a l = 238,5 nm. Si supponga, inoltre, che sia disciolto in una matrice che interferisce a l = 238,5 nm.
4 Schema generale Caratteristiche chimico-fisiche dell analita Caratteristiche della matrice Livello di accuratezza e precisione Sensibilità richiesta Scelta del metodo analitico (strumentazione, preparazione del campione, ecc) Ricerca in banche dati
5 Ricerca delle proprietà chimico-fisiche (PubChem)1
6 Ricerca delle proprietà chimico-fisiche (PubChem)2
7 Ricerca delle proprietà chimico-fisiche (PubChem)3
8 Ricerca delle proprietà chimico-fisiche (PubChem)4
9 Ricerca delle proprietà chimico-fisiche (SciFinder)
10 Ricerca del metodo analitico (PubMed)1
11 Ricerca del metodo analitico (PubMed)2
12 2. Sviluppo e convalida del metodo strumentale Questa fase prevede l utilizzo di uno standard dell analita e consente di mettere a punto e di ottimizzare le condizioni cromatografiche per meglio determinare l analita (es. simmetria picco, tempo di ritenzione, precisione, accuratezza, sensibilità, ecc). Se i risultati soddisfano i requisiti iniziali si passa alla convalida del metodo che consente di assicurare che la metodica analitica sia accurata, specifica, riproducibile e robusta. Tale fase assicura quindi l attendibilità del metodo.
13 Convalida del metodo analitico Nella convalida di un metodo analitico, è necessario valutare: limite di rivelamento (LOD); limite di quantizzazione (LOQ); precisione; accuratezza; specificità; linearità e range; robustezza.
14 Il limite di rilevamento (LOD) Il limite di rilevamento (Limit Of Detection, LOD) è definito come la più piccola quantità di analita che può essere determinato, anche non quantitativamente. Dato un bianco analitico, è formalmente definito da: x x B = 3. s B dove x ed x B sono i segnali ottenuti rispettivamente per il campione e per il bianco, mentre s B è la deviazione standard della misura del bianco. Si determina dal rapporto segnale/rumore di fondo che deve essere almeno di 3:1. Il LOD può inoltre essere determinato nel seguente modo: LOD = 3,3 / S dove è la deviazione standard della risposta strumentale e S è la pendenza (slope) della curva di calibrazione. può essere determinata dalla risposta dei bianchi (matrice priva dell analita) oppure è la deviazione standard della regressione lineare.
15 Il limite di quantificazione (LOQ) Il limite di quantificazione (Limit Of Quantification, LOQ) è definito come la più piccola quantità di analita che può essere quantizzata con accettabile precisione e accuratezza. Si determina dal rapporto segnale/rumore di fondo che deve essere almeno di 10:1. E formalmente definito da: x x B = 10. s B Il LOQ può inoltre essere determinato nel seguente modo: LOQ = 10 / S dove deviazione standard della risposta strumentale e S è la pendenza (slope) della curva di calibrazione.
16 L accuratezza L accuratezza è la misura dell errore sistematico (BIAS) e quindi indica l esattezza del metodo. Misura la prossimità dei risultati ottenuti al valore vero: BIAS = [(valore misurato valore vero) / valore vero]. 100 L accuratezza si determina su almeno 9 determinazioni e un minimo di 3 livelli di concentrazione (per es. tre ripetizioni per tre differenti concentrazioni). Accuratezza Intra-day o Intra-assay Riferita ad un singolo set di campioni Inter-day o Inter-assay Riferita a differenti campioni Analizzati in giorni differenti Criteri di accettabilità: entro 15 % per tutte le concentrazioni < 20 % al LOQ
17 La precisione La precisione è la misura dell errore casuale ed è definita come la misura del grado di concordanza tra misure individuali replicate più volte con lo stesso procedimento analitico. Si esprime come coefficiente di variazione % (CV%) Precisione intra-assay o intra-day CV% = (deviazione standard / valore medio). 100 E definita anche come ripetibilità e si riferisce all uso del procedimento analitico in uno stesso laboratorio, in un breve periodo di tempo, con lo stesso analista e stesso equipaggiamento. Può essere determinata usando almeno 9 determinazioni con 3 concentrazioni differenti (3 concentrazioni, 3 repliche per ogni concentrazione) oppure 6 determinazioni al 100% della concentrazione teorica. Precisione inter-assay o inter-day E definita anche come riproducibilità e si riferisce all uso del procedimento analitico in laboratori differenti (gironi, analisti, equipaggiamenti differenti). Precisione intermedia Esprime la variazione delle misure all interno dello stesso laboratorio, ma in gironi differenti.
18 La specificità 1 La specificità è la capacità del metodo di misurare in maniera accurata e specifica l analita di interesse in presenza degli altri componenti la matrice. La specificità indica quindi se la risposta del picco attribuito all analita è dovuta solamente all analita stesso o dipende da altri picchi interferenti (co-eluizione). La specificità è misurata valutando: 1) il test di purezza del picco, ottenuto comparando lo spettro UV registrato in almeno tre punti del picco cromatografico dell analita: Spettro Purezza 764 Purezza 999 2) il fattore di asimmetria: l nm l nm Impuro Puro Segnale Tempo (min)
19 La specificità 2 3) Se è disponibile la matrice priva dell analita, la specificità viene inoltre determinata analizzando almeno 6 differenti matrici e valutando la presenza di picchi interferenti al TR dell analita:
20 La robustezza La robustezza indica la refrattarietà dell accuratezza e della precisione di un saggio alle variazioni del metodo come la temperatura, il ph, la percentuale della fase organica, ecc. Si valuta alterando deliberatamente alcuni parametri. Nel caso della cromatografia liquida, si valutano le variazioni dei seguenti parametri: ph della fase mobile; composizione fase mobile; colonne; temperatura; flusso. Nel caso della gascromatografia: colonne; temperatura; flusso.
A cura di P.I. Antonio Caprai e-mail: caprai@iirg.pi.cnr.it tel. ++39 050 3152391
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