Classification of cell death

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Amando Righi
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1 Classification of cell death Cell death Necrotic Physiological apoptosis autophagic other Caspase-dependent Caspase-independent receptor-caspase 8 mitochondria-caspase 9

2 Il segnalamento apoptotico

3 Two lymphocytes Staurosporin-treated HeLa cells Healthy Apoptosi s Apoptosi s Apoptoti c Weinberg Fig 9.18 Different parts of the apoptotic programme. Markers for the process. Fragmentation of DNA Pyknotic nuclear fragments Apoptotic cell Fragmentation of Golgi bodies Phosphorylation of Histone 2B Phagocytosis of apoptotic bodies

5 Apoptosi Caratteristiche morfologiche associate a morte cellulare che portano alla dissoluzione della cellula e alla fagocitosi. Caratteristiche biochimiche associate a morte cellulare Frammentazione del DNA a livello internucleosomale con formazione di frammenti di 200bp e multipli Alterazione della compartimentalizzazione di lipidi di membrana con esposizione della fosfatidilserina e altre proteine riconosciute dai fagociti Apoptosi: frammentazione del DNA

6 Via estrinseca o citoplasmatica APOPTOSI Via intrinseca o mitocondriale Fas:fasL Famiglia Bcl-2 recettori della morte bid rilascio di citocromo C Via finale comune: Attivazione di una cascata di proteasi (CASPASI) Proteolisi di molecole regolatorie e strutturali

Recettori della morte (famiglia TNFR) MEMBRANA CELLULARE DD I RECETTORI DELLA MORTE TNF-R1 (CD120a) CD95 (APO-1:Fas)

7 L apoptosi può cominciare a seguito di diversi stimoli quali: 1. Deprivazione di fattori di crescita 2. Radiazioni UV e g 3. Chemioterapici 4. Recettori della morte (famiglia TNFR) MEMBRANA CELLULARE DD I RECETTORI DELLA MORTE TNF-R1 (CD120a) CD95 (APO-1:Fas) DR3 (APO-3, LARD, TRAMP, WSL1) TRAIL-R1 (APO-2, DR4) TRAIL-R2 (DR5, KILLER, TRICK2) DR6 possiedono un dominio intracellulare definito death domain (DD), essenziale per la trasduzione del segnale apoptotico

8 Segnalamento apoptotico-ruolo della Matrice Extracellulare I ligandi dei recettori della morte sono trimeri di membrana che vengono rilasciati da metalloproteinasi di matrice (MMPs) LIGANDI: TNFa prodotto da monociti/macrofagi TWEAK (APO-3L) FasL FasL-Fas system = linfociti T citotossici Linfotossina (LTa, LTb) prodotti da linfociti attivati LIGHT TRAIL (APO-2L) TNFa MMP MMP TNFR

FADD/Mort1 Fas-Associated-Death-Domain protein RIP

9 A seguito della trimerizzazione i recettori della morte legano tramite i domini DD delle molecole adattatrici : FADD/Mort1 Fas-Associated-Death-Domain protein RIP Receptor-Interacting-Protein TRADD TNF-Associated-Death-Domain protein

10 FADD TRADD RIP

11 Legame di FASL al suo recettore Induzione di trimerizzazione Reclutamento di Fadd e di caspasi 8 (DISC: death-inducing signalling Complex) Attivazione di caspasi 8

12 Il segnalamento apoptotico - Gli enzimi Caspasi Le caspasi vengono divise in iniziatori e effettori. Le proteine adattatrici legano le caspasi iniziatrici connettendo il recettore al macchinario apoptotico effettore costituito da una sequenza di caspasi Caspasi-10-8 DED = Death Effector Domain Caspasi CARD = Caspase Recruitment Domain Caspasi Caspasi DEDD TRADD FADD RIP APAF = Apoptopic Proteases Activating Factors Effettori Apoptotici Processamento di citochine prima della secrezione

13 Tutte le caspasi sono sintetizzate come zimogeni, e necessitano di essere attivate da taglio proteolitico. L enzima attivo è un eterotetramero formato da 2 subunità catalitiche di circa 20 kda e da 2 subunità di circa 10 kda Pro-Caspasi-8 FADD FADD Pro-Caspasi-8 Attivazione autoproteolitica Attivazione autoproteolitica Caspasi 8

14 Le caspasi iniziatrici attivano le esecutrici eventualmente portando la cellula in apoptosi TNF TNFR APOPTOSI FADD TRAF TRADD Pro-Caspasi-8 Pro-Caspasi 3/6/7 Caspasi-3/6/7 Caspasi-8

15 Le IAP (inhibitor of apoptosis) costituiscono una importante classe di regolatori dell apoptosi IAP-1 e IAP-2 XIAP (X-chromosome-linked inhibitor apoptosis protein ) Survivin ML-IAP Bruce Livin ciap-1 e -2 si legano ai TRAFs (TNF-receptor associated factors) 1 e 2 Survivin é implicata nel controllo del ciclo cellulare XIAP inibisce le caspasi-3, -6 e -7 ML-IAP inibisce le caspasi-3, -7, -9 Modulatori delle IAP Inibitori degli inibitori Smac/Diablo

La famiglia delle proteine Bcl-2 (B cell lymphoma gene 2) Più di 30 regolatori dell apoptosi, comprendono INIBITORI e PROMOTORI Si localizzano sulla membrana mitocondriale esterna, del reticolo

16 La famiglia delle proteine Bcl-2 (B cell lymphoma gene 2) Più di 30 regolatori dell apoptosi, comprendono INIBITORI e PROMOTORI Si localizzano sulla membrana mitocondriale esterna, del reticolo endoplasmico e del nucleo Inibitori di apoptosi: Bcl-2 Bcl-XL Bcl-xs A1 Boo Mcl-1 DIMERI Proteine anti- e pro-apoptopiche formano eterodimeri regolatori. I livelli relativi di queste proteine possono decidere se la cellula muore o sopravvive Promotori di apoptosi: Bax Bak Bok Bad Bim/Bod Bid Bik/Nbk/Blk Bmk Hrk/DP5 Noxa Puma/Bbc3

Il segnalamento apoptotico La famiglia delle proteine Bcl-2 Pro-Sopravvivenza Famiglia Bcl2 Pro-Apoptosi Famiglia Bax ( formatori di canali/pori

17 Il segnalamento apoptotico La famiglia delle proteine Bcl-2 Pro-Sopravvivenza Famiglia Bcl2 Pro-Apoptosi Famiglia Bax ( formatori di canali/pori mitocondriali ) Bax Bak Bok Bcl2 Bcl-X L Bfl-1 Bcl-W Mcl1 Famiglia BH3-only ( sentinelle dell apoptosi ) Bid Bad, Bim, Bik, Bmf, Hrk, Noxa, Puma

Bad, Bim and Bid sono mantenute inattive in

Deprivazione di Mitogeni Transienti di [Ca 2+

18 Bad, Bim and Bid sono mantenute inattive in cellula e, se attivate da segnali citotossici, si legano ad altre proteine apoptotiche Cellula sana Iniziazione dell apoptosi Deprivazione di Mitogeni Transienti di [Ca 2+ ] Taxolo Deprivazione di mitogeni Membrana Mitocondriale esterna

19 Effetti pro-apoptotici del Calcio sequestra BAD Bad Apaf-1 P Apaf-1 Chinasi Akt/PKB PKA Fosfatasi Calcineurina Bad Bad SOPRAVVIVENZA MORTE

20 Le BH3-only nell attivazione dell apoptosi Segnale apoptotico BH3 only BH3 only Bid. Bad. Bim. Bik. Bmf. Hrk. Noxa. Puma. Cyto C

21 Molti stimoli apoptotici sono in grado di avviare l apoptosi attraverso una via mitocondriale Radiazioni, stress DEX, staurosporina deprivazione mitogeni Ceramide p53 Procaspasi-9 Mitocondrio Cyto-C Cyto-C Bcl-2 ATP Rilascio del citocromo c dallo spazio intermembrane e rilascio di Apaf-1 (Apoptopic Proteases Activating Factor) che smaschera il dominio CARD di Apaf-1 APAF-1 card APAF-1 card caspasi-9 card Cyto-C APAF-1 APOPTOSOMA

22 Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 1 TNF TNFR Il citocromo c è rilasciato anche a seguito di attivazione dei recettori della morte a causa dell attivazione di Bid da parte di caspasi 8 Pro-Caspasi-8 FADD TRADD Neutralizzazione di Bax o Bak tbid Bax Bcl-2 Bcl-xL TRAF Bcl-2 Bcl-xL Bax Bak tbid Bax tbid Bak tbid Bax tbid Bak Cyt C Bid tbid Cyt C tbid Bax tbid Bax tbid tbid Bak Bak

23 Apoptosi tramite recettori della morte e mitocondrio - modello 2 il PTP TNF TNFR Il cit c è rilasciato anche attraverso il PTP. Dal mitocondrio vengono rilasciati anche Smac/DIABLO, Omi/HtrA2 e AIF Pro-Caspasi-8 FADD TRADD Bcl-2 Bcl-xL TRAF Bak Bax tbid Bax tbid Bak AIF Bid tbid Cyt C Cyt C Omi/HtrA2 = serina-proteasi Smac/DIABLO = second mitochondriaderived activator of caspases/direct IAPbinding protein with low pi AIF = Apoptosis Inducing Factor (attivatore di endonucleasi) Omi/HtrA2 Smac/Diablo AIF VDAC VDAC ANT ANT PTP canale anionico voltaggio-dipendente traslocatore di adenin nucleotide Omi/HtrA2 Smac/Diablo

24 sopravvivenza apoptosi Smac/DIABLO = second mitochondria-derived activator of caspases/direct IAP-binding protein with low pi Smac/Diablo Omi/HtrA2 Omi/HtrA2 = serina-proteasi

ROS indica i metaboliti parzialmente ridotti dell O 2.

definiti come veri radicali liberi. Altri ROS, tipo H 2 O 2, sono più propriamente pro-ossidanti.

1-5% degli elettroni che fluiscono nella catena respiratoria possono essere dirottati a realizzare O2 - a

ossidoriduttasi). O2 - viene poi convertito da SOD mitocondriale in H 2 O 2, che si riversa nel citoplasma.

25 ROS indica i metaboliti parzialmente ridotti dell O 2. Alcuni di loro tipo O 2 - (anione superossido) e OH - (radicale idrossilico o ossidrile), possono essere definiti come veri radicali liberi. Altri ROS, tipo H 2 O 2, sono più propriamente pro-ossidanti. O2 -, OH - e H 2 O 2 sono i ROS più rilevanti in condizioni fisiologiche e patologiche Mitocondri Circa il 1-5% degli elettroni che fluiscono nella catena respiratoria possono essere dirottati a realizzare O2 - a livello del complesso I (NADH/ubiquinone ossidoriduttasi) e complesso III (ubiquinol/citocromo c ossidoriduttasi). O2 - viene poi convertito da SOD mitocondriale in H 2 O 2, che si riversa nel citoplasma. NADPH ossidasi NOX è costitutivamente attivo e produce livelli molto bassi di ROS; in risposta a vari fattori cellulari l attività di NOX aumenta e aumenta la produzione dei ROS

Lo stress ossidativo attiva numerose e importanti vie di trasduzione dei segnali ROS producono effetti diversi in base alla severità del danno, al tipo di cellula e alla durata dell esposizione.

26 Lo stress ossidativo attiva numerose e importanti vie di trasduzione dei segnali ROS producono effetti diversi in base alla severità del danno, al tipo di cellula e alla durata dell esposizione. In genere, basse dosi di ROS, in particolare perossido d idrogeno, sono mitogenici e promuovono la proliferazione cellulare; dosi intermedie provocano un temporaneo o permanente blocco della crescita ROS modulano la funzione di molti enzimi (box) e fattori di trascrizione (ovali) tramite molti segnalamenti intracellulari. Questi segnali cambiano l espressione genica influenzando la sopravvivenza ela morte HSF1, heat shock transcription factor 1

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