E POSSIBILE FAR EVOLVERE LE PROTEINE IN LABORATORIO

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Agostina Russo
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1 E POSSIBILE FAR EVOLVERE LE PROTEINE IN LABORATORIO EVOLUZIONE GUIDATA PROTEINE CON FUNZIONI OTTIMIZZATE O NUOVE

2 L EVOLUZIONE NATURALE RICHIEDE TEMPO VARIABILITA GENETICA Ricombinazione Mutazione Selezione IN LABORATORIO UN ESPERIMENTO DI EVOLUZIONE GUIDATA PUO ESSERE COMPLETATO IN ALCUNI MESI

3 EVOLUZIONE GUIDATA - STRATEGIA GENERALE IL PERCORSO SEGUITO DA UNA PROTEINA NEL CORSO DELLA SUA EVOLUZIONE PUO ESSERE DESCRITTO COME: Fitness landscape (scenario del successo evolutivo): descrive le possibilità che si presentano ad una data proteina in termini di fitness. Per esplorare queste possibilità la sequenza della proteina deve variare all interno di uno. Spazio di sequenza: La complessità della diversità dei sistemi proteici: 20 n E MOLTO DIFFICILE ESPLORARE TUTTE LE POSSIBILITA IN UN TEMPO RAGIONEVOLE LA VARIABILITA DELLA POPOLAZIONE DI PROTEINE DA OTTENERE DI SOLITO E LIMITATA DA RAGIONI OGGETTIVE

4 STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE DIRETTA Complessità (genotipo) Espressione Identificazione del fenotipo

5 PRINCIPALI STRATEGIE DI ESPRESSIONE Requisito essenziale: associazione genotipo-fenotipo librerie di espressione in procarioti ed eucarioti (cell display) librerie di espressione su batteriofagi (phage display) Problemi: efficienza di introduzione del DNA nelle cellule librerie di espressione su ribosomi (ribosome display) - mrna tradotti in vitro su ribosomi - arresto della traduzione indotto - la proteina viene esposta sulla superficie del ribosoma Problemi: valido soprattutto per proteine con proprietà di legame

6 IDENTIFICAZIONE DEI CLONI SELEZIONE IN VIVO SCREENING

7 Alcune proprietà misurabili: -torbidità -ph -Assorbanza/fluorescenza -Calore SCREENING

8 CONFRONTO TRA STRATEGIE DI IDENTIFICAZIONE METODO VANTAGGI LIMITI SELEZIONE (connessione attività-vitalità cellulare) selezione dei positivi falsi positivi (vitali ma non ottimali) eliminazione di varianti misura indiretta non volute enzimatica saggi su popolazioni complessità della molto vaste (ca ) manipolazione SCREENING (cloni individuali - spesso richiesti substrati cromogenici o fluorogenici) saggio di attività diretto complessità della manipolazione saggi in condizioni saggi su popolazioni non vaste non naturali (ca se automatico valutazione di più parametri precisione abbassa la resa

9 CHE VUOL DIRE POPOLAZIONE COMPLESSA? IN REALTA I VALORI CHE SI RAGGIUNGONO SONO INFERIORI (20-40%)

10 METODI PER CREARE UNA POPOLAZIONE COMPLESSA MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI ESTESE minore livello di complessità ma su tutta la sequenza ceppi ad elevata frequenza di mutagenesi mutageni chimici PCR a bassa fedeltà (error-prone) - attività 3 ->5 esonucleasica - MnCl2 - - sbilanciamento dei precursori - numero di cicli aumentato - ph *Problemi: preferenza di mutazioni A<->G e T<->C bassa probabilità di sostituzioni multiple vicine Random Insertion deletion mutagenesis (RID): tagli casuali con Cs(IV)-EDTA

11 MUTAGENESI CASUALE SU REGIONI LIMITATE Maggiore livello di complessità locale Frammenti del gene originario sono sostituiti da oligonucleotidi sintetici contenenti: - singole posizioni casuali - più posizioni casuali - sottoframmenti semi-casuali *Oligonucleotidi: sintesi automatica in fase solida (codoni di stop evitati --> solo G o C in terza posizione

12 In generale i risultati migliori si ottengono inserendo poche mutazioni per volta in cicli successivi

13 STRATEGIA GENERALE DI EVOLUZIONE GUIDATA Gene originale Mutazioni Moltissimi Geni Mutati MOLTE MUTAZIONI LETALI Directed Evolution Proteine Identificazione della proprietà voluta

14 PER EVITARE LE VARIANTI NON FUNZIONALI SI PUÒ SFRUTTARE IL LAVORO GIÀ FATTO DALLA EVOLUZIONE NATURALE! In natura In laboratorio

15 RICOMBINAZIONE UTILIZZA LA VARIABILITA GIA PRESENTE IN REGIONI SEPARATE DI UNA SEQUENZA (O PIU SEQUENZE) DNA shuffling: frammentazione + PCR StEP (Staggered Extension Process): estensione corta + PCR Random-priming: primers casuali + PCR

16 RICOMBINAZIONE SU GENE SINGOLO

17 SU GENI MULTIPLI DI UNA FAMIGLIA PROTEICA Incroci di molecole

18 LO SPAZIO DI SEQUENZA ESPLORATO E MOLTO DIVERSO

19 ANCHE I RISULTATI SONO DIVERSI! Identità CEFALOSPORINASI Singolo ciclo

20 L EVOLUZIONE GUIDATA HA PRODOTTO RISULTATI IMPORTANTI INTERFERONI = AGENTI ANTIVIRALI E ANTITUMORALI 20 GENI NON-ALLELICI DUPLICATI CON ELEVATA IDENTITA DI SEQUENZA (85-98%) DNA SHUFFLING SU IFN-alfa2a

21 GLI ESPERIMENTI DI EVOLUZIONE GUIDATA HANNO AVUTO MENO SUCCESSO DEL PREVISTO MIGLIORARE LE FUNZIONI ESISTENTI E PIU FACILE CHE TROVARE FUNZIONI NUOVE SI TROVA QUELLO CHE SI CERCA! COSA CI SUGGERISCE? PROTEINE PRIMORDIALI = PROTEINE TUTTOFARE PROTEINE MODERNE= PROTEINE SPECIALIZZATE

NATURALE MUTAZIONI NEUTRALI SELEZIONE NO SELEZIONE NUOVA

22 I PIU RECENTI ESPERIMENTI DI EVOLUZIONE GUIDATA SONO CONCETTUALMENTE DIVERSI E FORSE PIU SIMILI ALLA EVOLUZIONE NATURALE MUTAZIONI NEUTRALI SELEZIONE NO SELEZIONE NUOVA FUNZIONE GENE ORIGINALE POPOLAZIONE VARIA, ROBUSTA E CON QUALITA NASCOSTE NUOVE FUNZIONI

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