Emolisi acute: Il laboratorio e il pronto soccorso a confronto Maggio 2014 Sestri Levante, Hotel Miramare

Transcript

1 Emolisi acute: Il laboratorio e il pronto soccorso a confronto Maggio 2014 Sestri Levante, Hotel Miramare - Asl 4 Chiavarese - - Sezione SIMEL LIGURIA - Il Laboratorio di 2 livello per le Anemie Emolitiche Ereditarie Giovanni Ivaldi - Daniela Leone Laboratorio di Genetica Umana - Settore Microcitemia Ospedali Galliera, Genova

2 Sommario: - Gli esami per le AE nel laboratorio di 2 livello - AE da carenza di G6PD AE da difetto di membrana - AE da Hb Instabili Conclusioni

3 Gli esami per le AE nel laboratorio di 2 livello: > Oggi si è portati a pensare che il laboratorio di 2 livello si occupi solo di test sul DNA atti ad una caratterizzazione genetica; > in realtà l analisi molecolare ha bisogno quasi sempre del dato preliminare biochimico e quindi vi sono esami non molecolari che ormai vengono eseguiti in laboratori di riferimento proprio per indirizzare in modo appropriato l approccio molecolare; > ciò accade anche nel caso della diagnosi di laboratorio delle anemie emolitiche e talvolta la conclusione presuntiva del 1 livello può trovare conferme definitive in esami biochimici mirati ad un costo certamente più contenuto; > comunque nel porre il quesito diagnostico al laboratorio di 2 livello è importante che il clinico faccia sempre riferimento ai test già eseguiti e alle eventuali precedenti conclusioni.

4 Gli esami per le AE nel laboratorio di 2 livello: > Oggi si è portati a pensare che il laboratorio di 2 livello si occupi solo di test sul DNA atti ad una caratterizzazione genetica; > in realtà l analisi molecolare ha bisogno quasi sempre del dato preliminare biochimico e quindi vi sono esami non molecolari che ormai vengono eseguiti in laboratori di riferimento proprio per indirizzare in modo appropriato l approccio molecolare; > ciò accade anche nel caso della diagnosi di laboratorio delle anemie emolitiche e talvolta la conclusione presuntiva del 1 livello può trovare conferme definitive in esami biochimici mirati ad un costo certamente più contenuto; > comunque nel porre il quesito diagnostico al laboratorio di 2 livello è importante che il clinico faccia sempre riferimento ai test già eseguiti e alle eventuali precedenti conclusioni.

5 Gli esami per le AE nel laboratorio di 2 livello: > Oggi si è portati a pensare che il laboratorio di 2 livello si occupi solo di test sul DNA atti ad una caratterizzazione genetica; > in realtà l analisi molecolare ha bisogno quasi sempre del dato preliminare biochimico e quindi vi sono esami non molecolari che ormai vengono eseguiti in laboratori di riferimento proprio per indirizzare in modo appropriato l approccio molecolare; > ciò accade anche nel caso della diagnosi di laboratorio delle anemie emolitiche e talvolta la conclusione presuntiva del 1 livello può trovare conferme definitive in esami biochimici mirati ad un costo certamente più contenuto; > comunque nel porre il quesito diagnostico al laboratorio di 2 livello è importante che il clinico faccia sempre riferimento ai test già eseguiti e alle eventuali precedenti conclusioni.

6 Gli esami per le AE nel laboratorio di 2 livello: > Oggi si è portati a pensare che il laboratorio di 2 livello si occupi solo di test sul DNA atti ad una caratterizzazione genetica; > in realtà l analisi molecolare ha bisogno quasi sempre del dato preliminare biochimico e quindi vi sono esami non molecolari che ormai vengono eseguiti in laboratori di riferimento proprio per indirizzare in modo appropriato l approccio molecolare; > ciò accade anche nel caso della diagnosi di laboratorio delle anemie emolitiche e talvolta la conclusione presuntiva del 1 livello può trovare conferme definitive in esami biochimici mirati ad un costo certamente più contenuto; > comunque nel porre il quesito diagnostico al laboratorio di 2 livello è importante che il clinico faccia sempre riferimento ai test già eseguiti e alle eventuali precedenti conclusioni.

7 Aspetti comuni ai difetti ereditari associati ad AE: esordio dei sintomi in età precoce ampia eterogeneità fenotipica elevato numero di mutazioni anche de novo necessità di percorsi diagnostici dedicati-misti utilità di estendere lo studio molecolare a possibili altri geni modificatori dell espressione fenotipica principale a sostegno di una più corretta correlazione fenotipo-genotipo

8 Trasmissione genetica: X-linked Anemie emolitiche da deficit enzimatici - AE da carenza di G6PD (Favismo)

9 Shunt dei pentosi: protegge il globulo rosso dal danno ossidativo

10 Via glicolitica: assicura energia alla cellula

11 Carenza di G6PD: - Interessa oltre il 5% della popolazione mondiale - La maggior frequenza in Africa, nel Mediterraneo e in Asia - In Italia è presente con una incidenza massima (15%) in Sardegna e minima (<1%) nelle regioni settentrionali - Attività enzimatica residua (REA) nelle femmine eterozigoti molto variabile (possibile inattivazione del cromosoma X) - Protezione nei confronti della malaria Classificazione WHO in rapporto al fenotipo clinico nel maschio affetto e della REA: Class 1: Enzyme deficiency with chronic nonspherocytic hemolytic anemia Class 2: Severe enzyme deficiency (less than 10%) Class 3: Moderate to mild enzyme deficiency (10-60%) Class 4: Very mild or no enzyme deficiency (60%) Class 5: Increased enzyme activity

12 Il ruolo del laboratorio nel Deficit di G6PD misura dell attività enzimatica: - (metodo di Beutler - cinetica di reazione a 340 nm) attività nell individuo adulto normale pari a U/gHb - valori sensibilmente più alti nel neonato, in soggetti portatori di trait talassemici o durante episodi emolitici - valori più bassi in soggetti anemici valutazione del rapporto G6PD/6PGD: - valori normali: > 1.1 Anche in questo caso occorre valutare le caratteristiche del soggetto esaminato. valutazione della mobilità elettroforetica della proteina enzimatica: - ( veloce, lenta normale )

13 Alterazioni dei globuli rossi nel sangue periferico di soggetti favici in crisi emolitica By: Il Favismo G.Sansone et al. (1958)

14 Anemia emolitica in maschio con deficit totale di G6PD: deformazioni eritrocitarie nel sangue periferico reticolocitosi e anisocromia

15 analisi molecolare quando: - nella donna il dosaggio enzimatico risulta borderline oppure per un approfondimento nell ambito di uno studio familiare; - nell uomo l attività enzimatica riscontrata o l anamnesi personale o familiare non correlano. La caratterizzazione può essere richiesta per il corretto inserimento in una classe di espressione fenotipica; - Informazioni dal 1 livello - Consenso - Estrazione DNA - Analisi con enzimi di restrizione per i difetti più frequenti - Sequenziamento diretto esone 6 (G6PD MED ) - Sequenziamento diretto di più esoni Consultazione di database dedicati Conclusioni e correlazioni genotipo-fenotipo

16 Rappresentazione schematica del gene G6PD con la localizzazione di alcune varianti sugli esoni 6 e 7) 3 G6PD-Med 563 C T G6PD-Tsukui del G6PD-Mexico City 680 G A G6PD-Sibari 634 A G Kb

17 G6PD MED : esone 6 C>T Ser>Phe (Classe II-WHO) - AE acuta - Soggetto normale Femmina eterozigote - Manifestazioni cliniche nel soggetto emizigote caratterizzate da AE acuta - Attività enzimatica residua (REA) nell emizigote inferiore a 1 U/gHb (v.r.n. > 10 U/gHb) - Nella donna eterozigote REA molto variabile: 5-10 U/gHb Maschio emizigote

18 Distribuzione e frequenze del deficit di G6PD < 0.5% 7-9.9% % % 3-6.9% 15-26%

19 Laboratori di riferimento che eseguono esami di 2 livello per i difetti del gene G6PD Richiesta di esami con il SSN: dosaggio G6PD estrazione DNA x (1-7) analisi sequenze

20 Trasmissione genetica: - autosomica dominante nel 75% dei casi - recessive nel 25% dei casi (molto gravi allo stato omozigote) - de novo nel 5% Anemie emolitiche da difetti della membrana eritrocitaria e/o citoscheletro - Sferocitosi ereditaria - Ellissocitosi ereditaria - Ovalocitosi - Piropoichilocitosi

21 Schema delle proteine di membrana che possono essere mutate nei difetti ereditari della membrana eritrocitaria Interazioni verticali (coinvolte nella sferocitosi ereditaria) Interazioni orizzontali (coinvolte nell ellissocitosi ereditaria)

22 Proteine coinvolte nei difetti genetici del citoscheletro eritrocitario

23 Dall esame quantitativo (e qualitativo) su SDS-PAGE al possibile difetto genetico

24 Alcuni parametri significativi

25 Alcuni test di screening

26 Classificazione della sferocitosi: variabilità clinica e gravità sulla base di alcuni parametri

27 Il ruolo del laboratorio nella sferocitosi: > morfologia eritrocitaria > reticolociti (aumentati) > resistenze osmotiche eritrocitarie (diminuite) > test più specifico come il test al glicerolo modificato (pink test) (v.n.<30%) > bilirubina indiretta e LDH (aumentati) > aptoglobina (diminuita) I laboratori di riferimento (2 livello): - studio delle diverse proteine della membrana eritrocitaria - analisi molecolare dei geni coinvolti sulla base delle indicazioni quali-quantitativa dello studio delle proteine: - del gene che codifica l anchirina - del gene che codifica la spectrina beta-1 - del gene che codifica la proteina del gene che codifica la banda 3

28 Sferocitosi Ellissovalocitosi Piropoichilocitosi

29 Laboratori di riferimento che eseguono esami di 2 livello per i difetti della membrana eritrocitaria Richiesta di esami con il SSN: Percorso e test di base test di lisi morfologia eritrocitaria x reticolociti Esami di 2 livello - Test biochimici non codificati x (...) analisi sequenze

30 Trasmissione genetica: - autosomica dominante Anemie emolitiche da difetti dell Emoglobina - Le Hb instabili

31 Classificazione delle Varianti Hb (Wajcman et al. Hemoglobin, 25:2,169, 2001) 1 Emoglobinopatie più frequenti che richiedono una adeguata prevenzione, come l Hb S nelle popolazioni di origine Africana, o l Hb E nelle popolazioni del Sud-Est Asiatico. 2 Varianti meno comuni rispetto a quelle del gruppo precedente (Hb C. Hb O Arab, Hb D Punjab ): diffuse in aree più ristrette, sono praticamente asintomatiche allo stato eterozigote ma gli individui portatori di una doppia eterozigosi tra questi difetti e l Hb S presentano un fenotipo clinico simile all Hb S disease 3 Varianti rare che producono disordini ematologici di vario tipo: Emoglobine instabili che danno luogo ad anemie emolitiche, Varianti con elevata affinità per l O 2 associate a eritrocitosi, Varianti con bassa affinità per l O 2 o methb (Hb M) che presentano cianosi.

32 Analisi molecolare per le Hb quando: - è presente nell assetto Hb osservato in HPLC o in elettroforesi una frazione anomala allo stato eterozigote che non è possibile confermare come HbS, HbC o HbE (queste varianti trovano conferme anche non molecolari); - pur non osservando alterazioni nell assetto Hb l anamnesi o il decorso clinico del paziente sono suggestivi per la presenza di un difetto globinico (è quello che accade con molte Hb instabili); - il paziente è stato trasfuso ed è necessario poter giungere ad una diagnosi (è quello che accade in molti casi di SCD); - c è il sospetto della presenza di un composto Hb (più difetti globinici coereditati); - è utile accertare l eventuale presenza di altri difetti a carico di geni modificatori

33 Esami di 1 livello: - Assetto emoglobinico - Test instabilità - Test funzionali - Aptoglobina - LDH Schema semplificato del percorso diagnostico molecolare per la conferma e/o caratterizzazione di difetti associati ad AE da Hb instabili - Informazioni dal 1 livello - Estrazione DNA - Screening molecolare - Consenso Eventuale analisi di geni modificatori Sequenziamento diretto dei geni globinici potenzialmente coinvolti Consultazione di database dedicati Conclusioni e correlazioni genotipo-fenotipo

34 Sequenza degli eventi associati alla denaturazione delle Emoglobine instabili

35

36 Confronto tra alcune Varianti Instabili delle Beta delle Alfa Catene Globiniche e Hb Variants HbX Ret. Met.Hb Term. BCB BCB BCB % % % a 37 C Time Size N.cells Hb Shepherds Bush Hb Belfast N Hb Köln Hb Genova Hb Volga Hb G St.Josè N N Hb Torino Hb Hasharon N N Sansone et al.: Haematologica, 72, 1987

37 Alcuni difetti del gene beta globinico che determinano grave instabilità della catena beta e che compromettono la formazione di catene beta (fenotipo talassemico-emolitico)

38 Inclusioni eritrocitarie e C.di Heinz in un soggetto splenectomizzato con Hb Koln Inclusioni eritrocitarie al microscopio elettronico a scansione Inclusioni eritrocitarie e reticolocitosi in un soggetto con Hb Belfast C.di Heinz in un soggetto splenectomizzato con Hb Genova

39 Laboratori di riferimento che eseguono esami di 2 livello per i difetti strutturali e talassemici dell Emoglobina Esami molecolari dei geni Hb Diagnosi prenatali per difetti Hb Richiesta di esami con il SSN: Esami di 1 livello intermedio termolabilità methb Esami molecolari estrazione DNA x1-7 analisi sequenze

40 Altri difetti globinici co-ereditati e geni modificatori - Alfa Talassemie - Beta Talassemie - UGT1A1

41 Sequenza del gene alfa2 in una famiglia con Hb Torino Soggetto normale Soggetto con fenotipo clinico normale eterozigote per Hb Torino Soggetto splenectomizzato con Hb Torino e alfa Tal. (-3.5kb)

42 UGT1A1: isoforma dell enzima UDP-glucoroniltransferasi Sindrome di Gilbert: Deficit dell enzima uridilgucoronil-transferasi. Tale enzima può essere ridotto dal 20 al 70% rispetto al valore normale (TA) 6 TAA normale...(ta) 7 TAA etero / omo...(ta) 8 TAA Ci sono numerose evidenze che confermano il ruolo dell UGT1A1 quale fattore modificatore nelle malattie emolitiche ereditarie. Questo è un chiaro esempio di gene modificatore che co-ereditato con un altro gene malattia determina l eterogeneità clinica nelle malattie monogeniche.

43 Grazie a voi tutti per l attenzione