PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATI EMOGLOBINA E MIOGLOBINA

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1 PROTEINE RESPIRATORIE DEI VERTEBRATI EMOGLOBINA E MIOGLOBINA Legano reversibilmente l OSSIGENO. La mioglobina (monomerica) è presente nelle cellule muscolari. L emoglobina (tetramerica) è presente negli eritrociti, e trasporta ossigeno nel sangue La mioglobina e l emoglobina sono proteine coniugate Aumenta la solubilità dell ossigeno nel plasma, da 3ml/L a 220 ml/l. Essenziale per la loro funzione è il legame con un gruppo prostetico: Il gruppo EME in cui è presente lo ione ferroso Fe 2+ che funziona da sito di legame per l O 2

2 GRUPPO EME 4 anelli pirrolici uniti da ponti metilenici (protoporfirina IX), struttura coniugata e planare che coordina il FERRO nello stato ferroso - Fe(II) (Fe 2+ )- Esso è coordinato dai 4 atomi di azoto dell anello tetrapirrolico

3 Il gruppo EME è alloggiato in una «tasca», formata dal ripiegamento della catena polipeptidica (globinica), in cui si affacciano diversi residui amminoacidici idrofobici (Val, Leu, Iso, Phe, Met) che interagiscono con l anello tetrapirrolico dell EME e lo mantengono in sede. interazioni idrofobiche, contatti di van der Waals e legami H Nella tasca idrofobica è impedito l ingresso all H 2 O e il Fe 2+ è protetto dall ossidazione irreversibile. Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

4 Lo ione Fe 2+ è coordinato dai 4 atomi di azoto dell anello tetrapirrolico, e forma altri 2 legami di coordinazione: con l ossigeno molecolare (O 2 ) e con l istidina prossimale (His93; His F8) Istidina prossimale His93 (His F8) Elica F della Catena globinica, Piano dell anello porfirinico

5 L interazione tra Ferro e Ossigeno è descritta dalla combinazione di 2 strutture di risonanza J. M. Berg et al. BIOCHIMICA 7/E Zanichelli editore S.p.a Copyright 2012 Lo ione ferroso Fe 2+ può legare O 2 Lo ione ferrico Fe 3+ non può legare O 2 La Mb o l Hb SI OSSIDANO (Meta-Mb o Meta-Hb)

6 La struttura della Mb o delle catene globiniche di Hb sono fatte in modo da proteggere il ferro dall ossidazione, ed evitare la formazione di ioni superossido La tasca dell EME è idrofobica e quindi è impedito l ingresso di acqua Esiste un sistema anti-ossidante che rimuove le specie reattive dell ossigeno (ROS) basato sull attività del glutatione. Nella tasca dell EME esiste un secondo residuo di ISTIDINA chiamato DISTALE che interagisce con l ossigeno e indebolisce il legame fra ossigeno e ferro

7 Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve) His-93 (F8) prossimale His-64 (E7) distale

8 La formazione e il rilascio dell anione superossido è impedito da un LEGAME H fra l O 2 e l Istidina DISTALE (His64, E7). Questo legame impedisce anche l ossidazione dello ione Fe 2+ a Fe 3+ His distale Il legame H fra O 2 e His-64 (distale) assicura che l interazione O 2 /Fe 2+ sia reversibile, abbassa l affinità dell eme per il suo ligando Val Val-68 e Phe-43 aiutano a mantenere l EME in posizione Phe His prossimale

9 La tasca dell EME può accogliere anche altre piccole molecole, come per es. il MONOSSIDO DI CARBONIO (CΞO) il CΞO lega il Fe 2+ dell EME con un affinità molto maggiore rispetto all O 2 (CO e Fe 2+ sono perfettamente allineati). Il monossido di carbonio blocca i siti di legame per l ossigeno nell Hb e nella Mb, rendendola non-funzionale. Si blocca la respirazione per intossicazione da CO. Il legame è molto forte ma reversibile, il CΞO può essere rilasciato in condizioni di alte pressioni di O 2 (camera iperbarica)

10 Mioglobina: 1 catena globinica composta da 8 α-eliche (indicate con le lettere da A a H) unite da segmenti di interconnessione (anse e curve) La Mb ha un solo gruppo EME, può legare 1 molecola di O 2. Si forma un complesso MbO 2 secondo un rapporto di 1:1. Il legame fra Mb e O 2 è reversibile ed è regolato secondo un equilibrio da una costante di dissociazione: Mb + O 2 MbO 2 Mb + O 2 MbO 2 K diss

11 [Mb] [O 2 ] K K diss = diss [MbO 2 ] Mb + O 2 MbO 2 Se la Kdiss è piccola l affinità proteina/ligando è elevata La concentrazione di proteina ossigenata (legata all ossigeno, MbO 2 ) rispetto alla concentrazione totale di Mb (Mb + MbO 2 ), varia al variare della concentrazione di ossigeno (ligando) fornito alla proteina. Questo rapporto è chiamato FRAZIONE DI SATURAZIONE DELLA Mb (si esprime in % o in frazione) Y = [MbO 2 ] [MbO 2 ] + [Mb] LA FRAZIONE DI SATURAZIONE DIPENDE DA: 1) dalla concentrazione del ligando [O 2 ] che si esprime come po 2 2) dall affinità che la proteina ha per il suo ligando, cioè dalla costante di dissociazione (K diss ) del complesso MbO 2

12 La frazione di saturazione Y, la concentrazione di O 2, e la K diss sono legate da una relazione matematica: [O 2 ] = po 2 (pressione parziale di ossigeno) [O 2 ] Y = K diss + [O 2 ] po 2 Y = K diss + po 2 Il valore della K diss corrisponde al valore di po 2 che consente di saturare la Mb al 50% (Y = 0.5). Questo valore di po 2 è detto p50 1 po Y = = 2 K diss + po 2 = 2pO 2 K 2 K diss + po diss = 2pO 2 - po 2 = po 2 2 Eq. di HILL Y = po 2 K diss = p50 p50 + po 2

13 La p50 è il parametro che misura l AFFINITA di una emoproteina per il suo ligando (l OSSIGENO). Più è grande il valore della p50 più è grande la K diss e quindi minore l affinità dell emoproteina per l O 2 Il valore della p50 e quindi della K diss si ricava sperimentalmente utilizzando il grafico di ossigenazione della Mb.

14 QUANDO SI MISURA la FRAZIONE di SATURAZIONE (Y) della Mb a DIVERSI VALORI di po 2 si OTTIENE UNA CURVA di LEGAME o OSSIGENAZIONE IPERBOLICA Tutti i siti di legame della Mb sono OCCUPATI O 2 Y = [MbO 2 ] [MbO 2 ] + [Mb] Y O 2 O 2 Tutti i siti di legame della Mb sono LIBERI 4 Pressione parziale di O 2 O 2

15 p50 della mioglobina è ~ 4 mmhg, la sua affinità per l O 2 è molto elevata È una caratteristica necessaria affinchè Mb sia funzionale: DEVE ESTRARRE O 2 DAL SANGUE E ACCUMULARLO NEL TESSUTO MUSCOLARE Nelle cellule muscolari metabolicamente attive: si consuma O 2 : la po 2 cellulare diminuisce < 10 mmhg Y po 2 nei capillari ~ 30 mmhg Nelle cellule muscolari a riposo: minore consumo di O 2 : la po 2 intracellulare è in equilibrio con quella del sangue capillare la Mb rilascia EFFICACEMENTE l ossigeno che aveva legato. Fase di deossigenazione Mb è quasi satura: accumula O 2 Fase di ossigenazione

16 Emoglobina (Hb): tetramero (le globine si associano formando due copie di dimeri αβ (α 1 β 1 e α 2 β 2 ) che si associano a formare un tetramero attraverso interazioni idrofobiche, legami H e ponti salini. Le interazioni si formano nell interfaccia α 1 β 1 e α 2 β 2 e α 1 β 2 e α 2 β 1 2 catene globiniche α (7 α-eliche) e 2 catene globiniche β (8 α-eliche) Ogni globina ha una tasca in cui lega un gruppo EME, quindi l Hb può legare e trasportare 4 molecole di O 2

17 Il grado di ossigenazione della Hb dipende dalla po 2 e dalla K diss del complesso Hb(O 2 ) 4. Hb + 4[O 2 ] Hb[O 2 ] 4 Frazione di saturazione: % di Hb ossigenata (di siti EME occupati dall O 2 ) rispetto all Hb totale Y = [Hb(O 2 ) 4 ] [Hb(O 2 ) 4 ] + [Hb] n po 2 Y= n p50 + po 2 n K diss = K diss = p50 n [Hb] [O 2 ] [Hb(O 2 ) 4 ] La Frazione di saturazione è legata alla po 2 e alla K diss secondo la seguente relazione: po 2 Y = 4n K 4 diss + po 2 n po 4 2 Equazione di HILL

18 Graficamente la relazione esistente fra Y e po 2 è rappresentato da una CURVA DI OSSIGENAZIONE SIGMOIDALE, infatti il legame Hb/O 2 è di tipo COOPERATIVO. a) L AFFINITA DELL Hb PER L OSSIGENO AUMENTA MANO A MANO CHE LE MOLECOLE DI O 2 OCCUPANO I GRUPPI EME. b) Esiste una cooperatività positiva fra i siti di legame dell ossigeno (fra i gruppi EME) Y 1, STATO R Hb ad alta affinità, raggiunge la saturazione Hb semisatura, con minime variazioni di po 2 si deossigena e si ossigena quasi completamente c) Il legame di 1 molecola di O 2 ad un gruppo EME facilita il legame di altre molecole di O 2 agli altri gruppi EME p50 ~ 26 mm Hg, valore di po 2 che satura il 50% dei siti di legame dell Hb 20,0 40,0 60,0 80,0 po 2 (mmhg) Hb a bassa affinità, poco ossigenata STATO T

19 Qual è il vantaggio per un organismo vivente nel possedere una proteina respiratoria che lega l O 2 in modo cooperativo? 1,00 po 2 presente nei capillari tissutali po 2 presente nei capillari polmonari 0.75 Mb Hb Y 0.50 Hb rilascia e lega efficientemente l ossigeno ,0 40,0 60,0 80,0 100,0 po 2 (mmhg)

20 Cos è n? n o n H = Coefficiente di Hill = indica il grado di cooperatività dei siti di legame per l O 2. Per la Mb n = 1 (NON COOPERATIVA) Per l Hb n > 1 ma MAI uguale al numero dei siti per l O 2, Le diverse emoproteine (per es. le diverse varianti di Hb prodotte a causa di mutazioni) possono avere un grado di cooperatività (n H ) differente Se l Hb avesse n H = 4, vorrebbe dire che tutte le molecole di Hb sono o completamente legate o completamente dissociate e il legame con l O 2 avviene contemporaneamente in tutti i siti. QUESTO NON AVVIENE.

21 In realtà in condizioni fisiologiche n H dell Hb è ~ 3 1< n H <N siti >> la proteina è Cooperativa e grazie alla cooperatività dei siti di legame subisce una transizione fra stato a bassa affinità (T) e stato ad alta affinità (R). Ciò vuol dire che, in uno stesso momento, avremmo una miscela di molecole di Hb completamente ossigenate, altre non ossigenate e altre parzialmente ossigenate. n H = 1 >> Non cooperativa (Mioglobina) n H < 0 >> Cooperatività negativa La cooperatività di legame dell emoglobina è possibile perché lo stato di ossigenazione di un sito può essere comunicato agli altri siti (SONO COOPERATIVI) attraverso un cambiamento della struttura dell Hb.

22 La transizione fra stato T e stato R è possibile perché quando l Hb si ossigena cambia struttura in funzione del legame con le molecole del suo ligando (O 2 ) e quindi della sua concentrazione (po 2 ). Infatti, Hb è una proteina ALLOSTERICA e l O 2 è il suo effettore allosterico omotropico 1) Ha più siti di legame per il suo ligando 2) Il ligando è un effettore omoallosterico: occupando uno dei siti di legame della proteina influisce sull affinità degli altri siti liberi 3) Il legame proteina/ligando causa sempre una modificazione della struttura 3 aria e anche della struttura 4 aria della proteina che modifica la sua affinità nei confronti del ligando stesso. 4) Ha siti di legame per altri ligandi che agiscono come molecole regolatrici (effettori eteroallosterici) che influenzano l affinità della proteina verso il suo ligando 5) La modulazione e il legame proteina/effettori è sempre REVERSIBILE

23 Modello simmetrico o MWC (Monod-Wyman-Changeaux): Una proteina allosterica è un oligomero che può esistere in due stati conformazionali (T e R) in equilibrio tra loro. Poiché il ligando si lega con maggiore affinità all oligomero in conformazione R, l equilibrio si sposta verso quest ultima: gli oligomeri con conformazione T sono costretti ad assumere quella R, dopo aver legato l ossigeno. Cambiamenti conformazionali contemporanei in tutte le subunità J. M. Berg et al., BIOCHIMICA, 7/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

24 Modello sequenziale (Koshland): Una proteina allosterica è un oligomero in cui il legame con il ligando induce la modificazione conformazionale della subunità a cui si lega. Grazie alla cooperatività e alle interazione fra le subunità, la transizione conformazionale è trasmessa anche alle atre subunità. Cambiamenti conformazionali sequenziali man mano che viene legato l ossigeno In realtà nell Hb la transizione conformazionale rispetta entrambi i modelli: - le variazioni nella struttura terziaria (T > R) causate nel primo sito di legame allo stato T quando vi si lega la prima molecola di ossigeno è sequenziale, - la variazione strutturale quaternaria da T a R avviene di concerto J. M. Berg et al., BIOCHIMICA, 7/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

25 STATO T Hb a bassa affinità α 1 β1 α 1 β1 α 1 β1 β2 α2 + O 2 β2 α2 β2 α2 α 1 β1 α 1 β1 β2 α2 β2 α2 Legame con la molecola di O 2 >> cambia la struttura 3 aria della subunità legata α 1 β1 + O 2 La Transizione idealmente si completa: quando sono occupati gli ultimi siti e tutte le molecole di Hb sono nella forma ad alta affinità α 1 β1 α 1 β1 β2 α2 α 1 β1 β2 α2 β2 α2 β2 α2 + O 2 α 1 β1 STATO R ALTA AFFINITA + O 2 CON LA PARZIALE OSSIGENAZIONE (almeno un sito occupato dall O 2 in ciascuno dei 2 dimeri αβ) l intera proteina modifica la sua struttura 4 aria assumendo una struttura piu disponibile ad accettare altre molecole di O 2. α 1 β1 α 1 β1 β2 α2 α 1 β1 β2 α2 β2 α2 β2 α2

26 COSA SUCCEDE ALLA STRUTTURA DELLA EMOGLOBINA QUANDO AVVIENE LA TRANSIZIONE T R? LA DEOSSI-Hb (STATO T) È STABILIZZATA DA UNA RETE DI LEGAMI IDROGENO E INTERAZIONI IONICHE INTRA- E INTER- CATENA. Nell interfaccia α1/β2 e α2/β1 si stabiliscono dei ponti salini fra l Asp94 e l His146 delle catene β e la Lys40 delle catene α Lys C5 o 40 His HC3 o 146 Asp FG1 o 94 C-term.

27 Il legame fra l EME e l O 2 produce il cambiamento strutturale nella proteina e il passaggio dallo stato T allo stato R. EME convesso EME appiattito Stato T Stato R Deossi-Hb: Il legame con l His prossimale trascina il Fe 2+ al di sotto del piano dell EME. Ossi-Hb: Il Fe 2+, trascinato all interno dell EME dopo il legame con l O 2, si tira dietro l His prossimale, tutta l elica F e i segmenti adiacenti rompendo le interazioni che stabilizzavano lo stato T.

28 Quando l Hb inizia a ossigenarsi, il legame EME/O 2 provoca un CAMBIAMENTO sia DELLA STRUTTURA TERZIARIA sia DELLA QUATERNARIA: un dimero α/β ruota e scivola rispetto all altro dimero α/β, questo movimento distorce e indebolisce la rete di legami H e ponti salini che stabilizza lo stato T, le catene beta si avvicinano e si restringe la cavità centrale (146) (146) (146) Nello stato R l estremità C-terminale (His-146, HC3) delle catene β è ruotato verso la cavità centrale e non può più formare ponti salini

29 =H3DHvJ_MEtk

30 Effettori eteroallosterici dell emoglobina H + (ph) CO 2 2,3-bisfosfoglicerato Regolano la transizione allosterica tra stato ad alta affinità e bassa affinità, aumentando l efficienza dell Hb nel rilasciare ossigeno ai tessuti. SONO EFFETTORI ALLOSTERICI NEGATIVI: diminuiscono l affinità dell Hb per l ossigeno SITI REGOLATORI: H + SI LEGANO SU CATENE LATERALI IONIZZABILI E SUI GRUPPI N-TERMINALI DELLE GLOBINE ALFA CO 2 SI LEGA SUI GRUPPI N-TERMINALI LIBERI DELLE GLOBINE BETA 2,3-bisfosfoglicerato SI LEGA NELLA CAVITA CENTRALE DEL TETRAMERO DI Hb

31 Effetto del ph: EFFETO BOHR TESSUTI Hb 4O 2 + nh + Hb nh + + 4O 2 POLMONI La diminuzione di ph nei capillari abbassa l affinità dell Hb verso l O 2 rendendone più efficiente il rilascio. La p50 sale da 26 a ~ 40 mm Hg

32 COME SPIEGARE IL MECCANISMO DELL EFFETTO BOHR? La DEOSSI-Hb ha una maggiore tendenza a protonarsi della OSSI-Hb, ha un pi più alto. L Hb ha vari siti di legame per gli ioni H + come: 1) ammino-gruppi N-terminali delle catene alfa 2) His 146, residuo C-terminale, delle catene β 3) altri.. Nei capillari tissutali, quando l Hb DEOSSI-Hb inzia a deossigenarsi, l His-146 delle catene β diventa più basica, il α-2 Lys40 STATO T suo pk R aumenta (> 7.2) + - COO - terminale delle catene β Nei capillari tissutali il ph è ~6.8 + β-1 His146 β-1 Asp94 - L His-146, acquista un H + e forma un ponte salino intra-catena con l Asp 94, che stabilizza la forma deossi-hb (stato T)

33 A livello polmonare l Hb inizia a legare O 2 : inizia la transizione allosterica (T > R), l His-146 delle catene β diventa più acida, il suo pk R diminuisce (~6.5 ) Nei capillari polmonari il ph è ~7.6, nel torrente circolatorio è ~7.2 (maggiore rispetto al pk R dell His-146). H l146 OOC C l CH 2 l H C N + CH C N H H O - H l94 C l CH 2 l C=O l L His-146 si trova nella sua forma DEPROTONATA e NON può formare il ponte salino con l Asp 94 Questo contribuisce al cambiamento strutturale che favorisce l ossigenazione completa della Hb.

34 ANIDRIDE CARBONICA (CO 2 ) La CO 2 viene liberata nel circolo sanguigno a livello periferico durante i processi metabolici cellulari. È trasportata nel sangue in tre forme: 1) Parte della CO 2 si lega all Hb nelle estremità N-terminali libere delle catene globiniche β formando CARBAMMATI = gruppi carichi negativamente che stabiliscono interazioni elettrostatiche con i residui di Arg-141 delle catene α stabilizzando la forma T

35 2) disciolta: obbedisce alla Legge di Henry come l'o 2 ma è 20 volte più solubile di questo. In questa forma costituisce il 10% del gas liberato dal sangue venoso nel polmone. 3) Diffonde all interno degli eritrociti dove è convertita in bicarbonato: CO 2 + H 2 O HCO H + (reazione catalizzata dall ANIDRASI CARBONICA) il bicarbonato, quando aumenta di concentrazione, diffonde dal globulo rosso al plasma scambiandosi con ioni Cl - Gli ioni H + si legano alla DEOSSI- Hb (che più basica della forma OSSI-Hb ed è quindi un accettore di protoni migliore) Contribuisce all effetto BOHR e quindi al rilascio di O 2

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37 CO 2 Effettore allosterico negativo per l Hb Y 1, Se la pco 2 diminuisce l affinità aumenta (p50 + bassa) Se la pco 2 aumenta l affinità diminuisce (p50 + alta) ,0 40,0 60,0 80,0 100,0 po 2 (mmhg)