LISATI DA COLTURA. GRAM-: crescita overnight su nutrient agar a 28 c singole colonie sospese in 50µl di tampone di lisi (0.05m NAOH, 0.

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1 LISATI DA COLTURA. GRAM-: crescita overnight su nutrient agar a 28 c singole colonie sospese in 50µl di tampone di lisi (0.05m NAOH, 0.25% SDS) agitate su vortex per 60s trattate a 95 c per 15 min centrifugate a rpm per 10 min diluizione 1:10 con acqua da PCR o tampone GRAM+: crescita per 48h su nutrient agar singole colonie sospese in 100 µl di tampone fosfato 0.01m + saccarosio 20% e lisozima 2.5mg/ml incubazione a 37 c per 45 min aggiunti 50µl tampone di lisi e agitate su vortex per 2 min trattate a 95 c per 30 min centrifugate a rpm per 10 min diluizione 1:10 con acqua da pcr o tampone FUNGHI-LIEVITI: Omogeneizzazione cellule/micelio freschi o polverizzati in N 2 liquido in tampone CTAB (200 µl), incubazione 10 a 4 C. centrifuga g. estrazione del surnatante con cloroformio-alcool isoamilico 24:1 per due volte fase acquosa trasferita e precipitata con etanolo freddo 1:2 centrifuga g a 4 C ed eliminazione del surnatante lavaggio del pellet con etanolo 70% ed essicazione

2 Estrazione DNA da matrice intera lavaggio con detergente, risciacquo acqua sterile, asciugatura eventuale sanitizzazione superficiale con H 2 O 2 30%, lavaggio con tampone Tris- HCl 10mM ph 7.6 eventuale pelatura strato superficiale rottura blanda in tampone Tris-HCl e incubazione 5 a 4 C eliminazione tampone usato e aggiunta tampone fresco, ripetizione incubazione-lavaggio per 3 volte aggiunta tampone CTAB (200 µl), centrifuga ed eliminazione surnatante, aggiunta tampone fresco (200 µl) omogeneizzazione totale, aggiunta di 5µl SDS 20%, incubazione 10 a 4 C. centrifuga g. estrazione del surnatante con cloroformio-alcool isoamilico 24:1 per due volte fase acquosa trasferita e precipitata con etanolo freddo 1:2 centrifuga g a 4 C ed eliminazione del surnatante lavaggio del pellet con etanolo 70% ed essicazione sospensione in TBE o acqua da PCR

3 TRADIZIONALE COLONNINE MAGNETIC BEADS OMOGENEIZZAZIONE SOSPENSIONE TAMPONE LISI CHIMICA/TERMICA LISI CHIMICA CENTRIFUGA --> SURNATANTE LISI CON DETERGENTE E PROTEASI (ca. 1h) a RT e/o con CTAB A 65 C LAVAGGIO- ADSORBIMENTO LAVAGGI IN CENTRIFUGA (2-3) AGGIUNTA BEADS INCUBAZIONE RAPIDA ESTRAZIONE FENOLO:CLOROFORMIO ELUIZIONE CATTURA CENTRIFUGA -->FASE ACQUOSA LAVAGGI VORTEX PRECIPITAZIONE ISOPROPANOLO CATTURA LAVAGGI ETANOLO Eventuale ELUIZIONE ESSICAZIONE SOSPENSIONE TAMPONE O ACQUA

4 1 2 Omogeneizzazione campione Sospendere in 200µl resuspension solution, 200µl cell lysis solution, mix per inversione sol. chiarifica 4 5 Trasferire in colonnina liquido trasparente senza residui Centrifugare 1 a max rpm, eliminare il filtrato Trasferire la colonnina in nuovo tubo, aggiungere 750µl sol. wash Centrifugare 1 a max rpm, eliminare il filtrato 3 Aggiungere 200µl sol. neutralizzazione, mixare per inversione, centrifugare rpm per 5 6 Mantenendo la colonnina nello stesso tubo, aggiungere 250µl sol. wash Centrifugare 1 a max rpm, eliminare il filtrato 7 8 Trasferire la colonnina in nuovo tubo, aggiungere 200µl Elution buffer (o acqua) a 70 C, mantenere qualche minuto a RT Centrifugare 1 a 8000rpm e raccogliere DNA

5 Dopo aver opportunamente omogeneizzato il campione si usano µl di sospensione sferette-tampone di lisi per aliquota di campione e si incuba 5 a RT Si cattura il complesso DNA-sferette con il magnete e si elimina il lisato. Si lava il complesso per 2-3 volte agitando in tampone di lavaggio e catturando di nuovo il complesso. Ultima sospensione in 20-40µl acqua da PCR o Elution buffer. Per eluire il DNA la sospensione viene trattata 5 a 65 C e dopo cattura delle particelle magnetiche si recupera il DNA.

6 Purificazione di amplificato da mix di pcr o da gel

7 Concentrazione di DNA e RNA nell'eluato: assorbanza a 260 nm Valori ottimali compresi tra 0.1 e 1. Purezza DNA e RNA nell'eluato: rapporto assorbanza 260/280, ottimale DNA ( g/ml) = A260 x 50 x fatt. dil. A 260 ds DNA = 1 50 µg/ml A 260 ss RNA = 1 40 µg/ml A 260 ss oligo = 1 33 µg/ml

8 Trasformazione per ottenere plasmidi ricombinanti

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10 Dopo coltura cellule su mezzo contenente X-Gal/IPTG: cellule con vettore senza inserto dotate di attività β-galattosidasica (colore blu) cellule con vettore con inserto non dotate di attività β-galattosidasica (colore bianco) cellule senza vettore non crescono

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13 Procedura per trasformazione Preparare mix per ligation, incubare da 15 min fino a un max di 2 h a 4 16 C Scongelare cellule competenti in ghiaccio e mezzo SOC a RT Aggiungere ligation mix a 50µl cellule, miscelare gentilmente e incubare 5 min in ghiaccio Trattare i tubi a 42 C per 30 sec poi incubare in ghiaccio per 2 min Aggiungere 250µl SOC e distribuire su agar LB contenente antibiotico, IPTG e X-Gal Esempio di distribuzione di volumi nelle piastre: 110µl, 80µl, 60µl, 40µl, 20µl Incubare a 37 C per 16-24h Prima di selezionare colonie blu/bianche porre 1h in frigorifero le piastre

14 Esempio procedura estrazione DNA plasmidico con colonnine Centrifugare 2ml di coltura O/N di cellule 1 min max velocità e eliminare surnatante Risospendere pellet in 200µl resuspension solution con vortex Aggiungere 200µl alkaline lysis solution, invertire 5 volte tubo Aggiungere 200µl neutralization solution agitando il tubo 4-6 volte Centrifugare 5 min max velocità Trasferire surnatante nella colonnina, aggiungere 200µl binding solution e centrifugare 1 min a 8000 rpm Eliminare il filtrato e aggiungere 750µl wash buffer e centrifugare 1 min a 8000 rpm Asciugare con centrifuga max velocità per 3 min Colonnina trasferita in tubo nuovo con aggiunta di µl elution buffer, incubare 1 min RT e centrifugare 8000rpm 1-10 min

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