La cinetica enzimatica: Calcolo della K m e V max

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1 La cinetica enzimatica: Calcolo della K m e V max Parametri cinetici K m (numericamente uguale alla concentrazione di substrato alla quale la velocità iniziale è pari alla metà della velocità massima) V max (velocità di reazione per una concentrazione di substrato tendente all infinito) 1

2 Le lipossigenasi (LOX) Catalizzano la reazione di ossidazione degli acidi grassi poliinsaturi formando i rispettivi idroperossidi. R-CH=CH-CH2-CH=CH-R R-C(OOH)-CH=CH-CH=CH-R Lipossigenasi di soia Vie di segnalazioni Funzioni delle LOX vegetali e animali Mobilizzazione lipidi Reazioni di perossidazione Intermedi: Ac. Jasmonico Terminali: 12-HETE β-ossidazione Fisiologica: neurotrasmissione Patologica: Ox LDL 2

3 Negli animali Diacilglicerolo PLC PLA 2 Acido arachidonico LOX H 2 O HPETE PGH2 sintasi COX-1/COX-2 perossidasi Leucotriene B 4 Leucotriene A 4 Glutatione PGD sintasi Prostaglandina D 2 Prostaglandine H 2 PGE sintasi Prostaglandina E 2 Prostaglandina F 2 Prostaciclina sintasi Prostaciclina Trombossano sintasi Trombossano A 2 Ac. glutammico Leucotriene C 4 Leucotriene D 4 Leucotriene E 4 Protocollo sperimentale: Tampone di saggio: Na-Fosfato 0.1 M ph 7.0 Substrato: acido linoleico 1,2 mm Enzima: lipossigenasi di soia 8 µm n di campioni da saggiare Bianco Buffer 990 µl 985 µl 965 µl 955 µl 935 µl 960 µl Ac. Linoleico 5 µl 10 µl 30 µl 40 µl 60 µl 40 µl LOX-1 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl - Volume totale 1 ml Miscela di dosaggio: 1 ml a 25 C Lettura a 234 nm (idroperossidi) 3

4 Metodo spettrofotometrico Occorre che substrato e prodotto abbiano un diverso assorbimento in qualche zona dello spettro (visibile-ultravioletto) Spettrofotometro Bianco costituito dal solvente fatta eccezione del campione a cui si vuole analizzare l assorbimento Sistema sdoppiamento raggi bianco Sistema riallineamento raggi Prisma campione Sorgente luminosa Monocromatore Comparto celle Rivelatore Luce: Visibile/ultravioletto Radiazione proveniente dal monocromatore si divide in due raggi che sono inviati al bianco e al campione contemporaneamente Il secondo raggio passa attraverso il campione e fuoriesce con l intensità trasmessa (I campione ) Il computer registra entrambe in modo alterno e calcola il rapporto 4

5 Relazione tra concentrazione ed assorbimento di una sostanza ad una certa lunghezza d onda sorgente mocromatore campione rilevatore I 0 I Legge di lambert-beer: A = LogI o /I =εcd c = concentrazione Molare (moli/l) della sostanza che assorbe la luce. d = lunghezza del cammino ottico espressa in cm. ε = Coefficiente di Estinzione Molare della sostanza che assorbe luce. Variazione di assorbanza Determinazione dell attività enzimatica Volume miscela di reazione Unità enzimatiche ΔA V tot UI = ε d t V e Coefficiente di estinzione molare Cammino tempo Volume dell enzima ottico legge di Lambert-Beer A = ε C d ΔA = ε ΔC d ΔC = ΔA / ε d Unità di misura: ΔA = A -1 ε = ml mmoli -1 cm -1 d = cm 5

6 Lipossigenasi: calcolo del ΔA/min Substrato utilizzato acido linoleico e lettura dell assorbanza a 234 nm 350 Assorbanza 234 nm ΔA/ Δt Pendenza della retta y = 92,143x - 37,857 R² = 0,9958 y = 67,143x - 33,333 R² = 0, ,5 1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 tempo (minuti) Variabile dipendente Variabile indipendente Y=m*x+q Coefficiente angolare o pendenza della retta intercetta Per determinare la velocità della reazione enzimatica in µmoli/min Sfruttiamo la legge di Lambert-Beer A = ε C d ΔA = ε ΔC d ΔA/min = ε x µmoli x cm L x min In base alle legge di Lambert-Beer, occorre conoscere il coefficiente di Estinzione molare (ε) dell acido linoleico a 234 nm ε = M -1 cm -1 Una soluzione di acido linoleico 1 µm viene convertita in una soluzione di 1 µm di 13S-HPOD (13S-hydroperoxy-9Z,11E-octadecadienoic acid) 6

7 Perciò, quando una soluzione di acido linoleico 1 µm viene convertita in una soluzione di 1 µm di 13S-HPOD (13Shydroperoxy-9Z,11E-octadecadienoic acid), Si ha: ε = 0,025 L µmoli -1 cm -1 Essendo il volume pari ad 1 ml ε = 25 ml µmoli -1 cm -1 Α = ε C d ΔA = ε ΔC d Unità di misura: ΔA = A -1 ε = ml µmoli -1 cm -1 d = cm ΔC = ΔA / ε d C/min = A x 1 ml min (A) x ml µmoli -1 cm -1 x cm C/min = µmoli min -1 = V 0 V 0 /V e = µmoli min -1 ml -1 = UE/ml 7

8 V max = k cat [E 0 ] Metodo di Lineweaver-Burk (metodo dei doppi reciproci) Linearizzazione dell equazione di Michaelis-Menten 1 [S] + K m K m 1 1 = = + v V max [S] V max [S] V max 1/V pendenza = K m V max 1/V max -1/K m 1/[S] 8

9 Risultati µm -1 min /V µm acido linoleico 0,5 0,4 0,3 K m /V max 0,2 1/V max 0,1-1/k m 0-0,02 0 0,02 0,04 0,06 0,08 1/[S] Parametri Cinetici LOX-1 K m (µm) ± 0.78 V max (µm min-1 ) ± 0.86 K cat (s -1 ) ± 9.0 K cat /K m (M -1 s -1 ) (10.2 ± 0.1)x10 6 Precauzioni nei dosaggi enzimatici Substrati e tamponi devono essere di alta purezza; L enzima purificato non deve contenere composti che interferiscono con il dosaggio; L enzima deve essere stabile; Controllo di ph e temperatura; La velocità deve essere costante nell intervallo considerato (v 0 ) 9