A. UBIALI Metodi per lo studio e la diagnosi molecolare dei tumori solidi: le neoplasie intestinali

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1 A. UBIALI Metodi per lo studio e la diagnosi molecolare dei tumori solidi: le neoplasie intestinali Torino, 11 giugno 2008

2 UN PO DI TEORIA Il concetto molecolare di malattia I livelli di studio del materiale genetico

3 UN PO DI TEORIA Il concetto molecolare di malattia I livelli di studio del materiale genetico

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5 Differenze genetiche non patologiche nella popolazione umana 1. Polimorfismi di singolo nucleotide (SNPs): sono la forma prevalente di differenza, costituita da variazioni di una singola coppia di basi (1 bp). 2. Minisatelliti: nucleotidi ripetuti più volte in tandem, fiancheggiati da sequenze uniche e caratteristiche. Un esempio è dato dai Variable Number Tandem Repeats (VNTR), che sono circa nel genoma. 3. Microsatelliti: simili ai minisatelliti ma con sequenze ripetute più piccole, ad esempio tetranucleotidi o anche solo dinucleotidi ripetuti in tandem.

6 Riassumendo DNA Satellite Differenze di lunghezza (molte bp in più o meno) CACA CACACACACACA GTGT GTGTGTGTGTGT CACA CA GTGT GT SNPs Differenze di sequenza a livello di 1 bp G C Può cambiare il sito di restrizione A T Può cambiare il comportamento di ibridazione con sonde (FISH, CISH)

7 La Patologia Molecolare La Patologia Molecolare é una branca della BM specializzata nell utilizzo di tecniche molecolari allo scopo di: Distinguere il normale dal patologico : diagnosi Predire la progressione di malattia: prognosi Fornire indicazioni mirate alla cura: terapia

8 La Patologia Molecolare La Patologia Molecolare considera tre tipi di anomalia genetica: Ereditaria (es. Fibrosi cistica, predisposizione ad alcuni tumori, ecc.) Somatica (mutazione accidentale da cui origina la patologia) Dovuta a presenza di DNA esogeno (virale o batterico)

9 UN PO DI TEORIA Il concetto molecolare di malattia I livelli di studio del materiale genetico

10 Livello clinico: sintomatologia Livello istologico: tessuto patologico Livello cellulare: anomalie citogenetiche Livello molecolare: mutazione sul DNA

11 Il danno molecolare Cromosoma intero: aberrazioni citogenetiche Geni o gruppi di geni: duplicazione, perdita, instabilità; mutazioni puntiformi

12 Il danno molecolare polisomie Citogenetica, FISH perdita macroscopica di materiale genetico Citogenetica, FISH mutazione genica PCR-based MB

13 Il danno molecolare A g e n te fis ic o o c h im ic o ; fa tto r i e r e d ita ri Danno sul DNA A b e r r a z io n i c r o m o s o m ic h e A b e r r a z io n i g e n o m ic h e M u ta z io n i p u n tifo r m i V a r ia z. e s p r e s s io n e C it o g e n e t ic a t r a d iz i o n a le o c o m b in a ta c o n F IS H ; CGH A n a li s i d e i m i c r o s a t e l l i t i; PCR S e q u e n z ia m e n to ; M a p p e d i re s tr iz io n e ; SSCP Q R T -P C R ; M ic r o a r r a y s

14 Cariotipo

15 WCP FISH

16 Il danno molecolare A g e n te fis ic o o c h im ic o ; fa tto r i e r e d ita ri Danno sul DNA A b e r r a z io n i c r o m o s o m ic h e A b e r r a z io n i g e n o m ic h e M u ta z io n i p u n tifo r m i V a r ia z. e s p r e s s io n e C it o g e n e t ic a t r a d iz i o n a le o c o m b in a ta c o n F IS H ; CGH A n a li s i d e i m i c r o s a t e l l i t i; PCR S e q u e n z ia m e n to ; M a p p e d i re s tr iz io n e ; SSCP Q R T -P C R ; M ic r o a r r a y s

17 Patologia molecolare nel tumore del grosso intestino

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20 Lo studio e la diagnosi molecolare dei tumori intestinali rappresentano un efficace esemplificazione delle diverse tecniche di Biologia Molecolare applicata in Anatomia Patologica. Di queste patologie sono noti molti processi patogenetici, che includono una serie di mutazioni progressive su antioncogéni (oncosoppressori) o su oncogéni.

21 BASE COUNT 2984 a 3125 c 3155 g 2958 t ORIGIN 1 bp upstream of EcoRI site. 1 gaattccagg ttggaggggc ggcaacctcc tgccagcctt 61 gccagaagag acagagcttg aggagagctt gaggagagca 121 ctgctgctca ctcagttcca caggtgggag gaacagcagg 181 tgcagatggg aaaacaaagg cccagagagg ggaagaaatg 241 ggcgacctca accacagccc agtgctggag ctgtgagtgg 301 cattcagcca gctcagggga aggacagggg ccctgaagcc 361 agggagctca gagagaaggg gaggggagtc tgagctcagt 421 ggtggtacct actcccttca cagggtaact gaatgagaga 481 caagtgtggc ccaccccacc ccagtgacac cagcccctga 541 atcaggaggg gctttctggg cacacccagt acccgtctct 601 cattttaatc ctcacagcag ctcaacaagg tacataccgt 661 tagggaaatt gaggctcgga gcggttaaac aactcacctg 721 gggttccctg gtctgaatgt gtgtgctgga ggatcctgtg 781 cccaaggtgg aggcataaat gggactggtg aatgacagaa 841 cattcactct gcaagtatct acggcacgta cgccagctcc 901 acagcggagc gatgcaatct gatttaggct tttaaaggat 961 tagcctcaac cctgtacctc ccctcccctc cacccccagc 1021 aaccccagag tgggggccat gtatccaaag aaactccaag 1081 ttttccagga gcaaaaacag aaacagcctg aggctggtca 1141 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ggggctcctg tctttctccc ggctcacatt ttacatcaaa ggacaggaag gctctgcacc agttactagt tggccccaaa ctcttgaacc aggaaacctg acctctctgt ccacccgacc tcctgtgcct 3061 aacattgctg 3121 ggggtcattg 3181 accgagggca 3241 gcggaatatc 3301 gctgcaggga 3361 ctgaaaggag 3421 gaaagctctt 3481 ggagggcagc 3541 tgaactgttg 3601 attttacaga 3661 gccagtaagt 3721 ctggtagagc 3781 tgcactcatc 3841 tgcgggttgc 3901 tgggacccac 3961 ggcctccaac 4021 atcacactgg 4081 tcctcctgct 4141 aagagcctac 4201 aaacttccaa 4261 ctgcctgagg 4321 cggcccccca 4381 ggaccatcaa 4441 tccgctccga 4501 ggcggcagta 4561 ctaccagtgg 4621 ctctcccaga 4681 tttctgagcc 4741 ggcaaagcgt 4801 tgtttgctcc 4861 tgcccctctg 4921 aggcaccacc 4981 tggagaggct 5041 gttgtggagt 5101 tcctattttc 5161 tcccccctcg 5221 gtctaggtct 5281 caacaaagcg 5341 tctgttgtct 5401 cttctataga 5461 ctccatcccc 5521 atgggcctcc 5581 ctgtgagggg 5641 aggccacggc 5701 gtgattccca 5761 tcacacacca 5821 tggccctagt 5881 ggctgaactt 5941 tctcttgggc 6001 ttgatctctg 6061 aagtgttgga ccaaggccaa caagaactgg atttaatttc 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22 Possibili percorsi genetici nell insorgenza del tumore del colon-retto. La maggior parte dei tumori si sviluppa secondo il modello tradizionale di Vogelstein (riquadro verde), ma una parte segue invece il pathway molecolare della instabilità microsatellitare (arancione) o altri percorsi e meccanismi, ancora parzialmente ignoti. MHAP=Mixed hyperplastic adenomatous polyp

23 Microsatelliti (MSI) Microsatelliti (LOH), PCR, analisi mutazionale

24 Analisi Microsatellitare nel tumore colorettale familiare o ereditario: Instabilità Microsatellitare (MSI)

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26 Il danno sul DNA Dimerizzazione delle timine in seguito a irradiamento con raggi ultravioletti

27 Il sistema di riparazione del DNA (Mismatch Repair System Genes, MMR)

28 Se il sistema di riparazione del DNA subisce o eredita una o più mutazioni, non funziona più correttamente e il DNA accumula mutazioni non riparate Le mutazioni alterano la funzionalità cellulare e predispongono allo sviluppo di tumori (fenotipo RER = Replication ERror) Le mutazioni alterano anche molti loci microsatellitari, che mostrano pattern diversi rispetto al DNA del tessuto normale

29 I microsatelliti ATATATATATATATATAT TGCCTGGCTAGCTTGCA Gene analizzato

30 Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer (HNPCC) N K Negativizzazione immunoistochimica delle proteine MMR

31 Lo studio dei microsatelliti prevede la loro amplificazione differenziata Microdissezione PCR per il MS del normale PCR per il MS del patologico

32 Metodica Microdissezione di sezioni fissate in formalina ed incluse in paraffina Estrazione e purificazione del DNA Amplificazione per i microsatelliti BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 e D17S250 (ed altri) Elettroforesi in acrilammide, colorazione argentica OPPURE ANALISI DI FRAMMENTO!

33 Risultati: MSI assay su gel MSI-H (3/5) MSI-H (5/5) MSI-H (4/5)

34 RISULTATI: MSI assay (f.a.) microsatellite stabile

35 RISULTATI: MSI assay (f.a.) microsatellite instabile

36 Gene sequencing per determinare le mutazioni coinvolte e la loro diffusione per ereditarietà

37 Limiti dei microsatelliti Necessità di arricchire la popolazione cellulare patologica con una microdissezione accurata. L intero processo (pannello) viene effettuato su un solo paziente alla volta e prende molto tempo. Costi di processazione relativamente elevati. Necessità di integrare i risultati con clinica e IIC.

38 Analisi Mutazionale nel tumore colorettale sporadico

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40 Geni coinvolti nella progressione tumorale e metodiche diagnostiche Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe

41 Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe

42 Il gold standard della BM su DNA: Southern Blot

43 Southern Blot sull antioncogene APC (adenomatosis polyposis coli)

44 Problemi del Southern Blot Il quantitativo di DNA iniziale deve essere molto alto (bassa sensibilità del metodo) Metodica macchinosa, lunga, costosa Utilizza metodi di rilevazione spesso obsoleti (ad esempio la radioattività lab attrezzato)

45 Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe

46 Southern Blot moderno : Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Si basa sui diversi pattern di digestione enzimatica che derivano da polimorfismi presenti all interno del DNA non codificante o direttamente in seguito alla mutazione nel gene studiato.

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48 RFLP sull oncogene K-RAS (Kirsten retrovirus associated sequence)

49 Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe

50 Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

51 SSCP sull antioncogene NM-23 (no metastasis gene)

52 Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe

53 Metodi basati sull associazione fra PCR e sonda (PCR+probe) Oligonucleotide ligation assay (OLA) Allele specific oligonucleotide (ASO) Line Probe Assay (LiPA) altri

54 In generale, si basano sulla possibilità di sondare in modo specifico un tratto genico (contenente ad esempio una sequenza anomala in seguito a mutazione) dopo amplificazione della regione che lo contiene.

55 Oligonucleotide ligation assay (OLA)

56 Esempi di risultati in OLA

57 Gene Mutazione Metodiche APC Delezione Southern Blot, PCR+probe K-RAS Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe DCC LOH Analisi dei Microsatelliti TP5 LOH Analisi dei Microsatelliti NM-23 Puntiforme RFLP, SSCP, PCR+probe

58 I microsatelliti ATATATATATATATATAT TGCCTGGCTAGCTTGCA Gene analizzato

59 Microdissezione PCR per il MS del normale PCR per il MS del patologico

60 Loss Of Heterozigosity (LOH) Le bande contenute nel tessuto normale sono confrontate con quelle del tumore: - Se sono identiche, identiche il gene è integro - Se nel tumore una o alcune bande sono perse, perse il corrispondente allele è stato eliminato dal cromosoma (LOH)

61 Loss Of Heterozigosity (LOH) endoc. esoc. N K N K LOH NO LOH MW

62 Gene MMR genes APC K-RAS DCC TP5 NM-23 Mutazione Tutte (o nessuna) Metodiche SAGGIO DI ESPRESSIONE DI UN GENE OVERESPRESSO O MUTATO: REAL-TIME PCR

63 Saggi di espressione: Real-Time PCR e Tissue Microarrays La Real-Time PCR è Quantitativa Serve per quantificare il numero di copie originariamente presenti nel campione di DNA (es. virus) o di RNA La misurazione avviene durante la FASE ESPONENZIALE di replicazione dell acido nucleico Il MICROARRAY è una matrice di molte RT-PCR eseguite contemporaneamente

64 Real-Time PCR innesco Forward Primer TaqMan R Probe Q Reverse Primer

65 Real-Time PCR rimpiazzo 5 Forward Primer R TaqMan Probe Q Reverse Primer

66 Real-Time PCR idrolisi R Q

67 Real-Time PCR completamento della polimerizzazione R Q

68 Real-Time PCR Segnale output R

69 Real-Time PCR: output Segnale output Campione Rn Rn Soglia CT 0 10 Controllo bianco N 20 Numero di cicli N = CICLO - SOGLIA

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71 Real-Time PCR: calcoli X0 = Xn Xn (1 + E)n Xn = prodotto di PCR dopo n cicli X0 = numero iniziale di copie E = coefficiente di efficienza X0 n = numero dei cicli n

72 Real-Time PCR: risultato 10ng 0.001ng

73 RT-PCR: quantificazione assoluta Per quantificare il numero di copie di RNA o DNA inizialmente presenti, è necessario avere degli standard interni molto precisi e rigorosi. Esiste anche una Quantificazione Relativa! Serve per quantificare un campione RELATIVAMENTE ad un altro (ad es. il campione A aveva 3 VOLTE l RNA del campione B). Si usa soprattutto in farmacogenomica e saggi di gene expression come i MICROARRAY

74 Microarrays

75 Microarrays

76 Microarrays

77 Gene MMR genes APC K-RAS DCC TP5 NM-23 Mutazione Tutte Metodiche SEQUENZIAMENTO DIRETTO DI UNA PARTE DEL GENE

78 Gene sequencing

79 Limiti e problemi della diagnostica molecolare in Anatomia Patologica

80 Limiti I tempi di risposta sono relativamente lunghi E necessaria una campionatura eseguita secondo rigide regole di conformità Il dato molecolare va inserito in un contesto piu ampio (istopatologico, clinico, di evoluzione della patologia, anamnestico,etc.)

81 Problemi Qualificazione, addestramento ed aggiornamento continuo del personale Corretta comunicazione con il patologo ed il clinico Elevato investimento iniziale / costo per metodica o per test

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