MECCANISMI DI CONTROLLO TRASCRIZIONALI E TRADUZIONALI

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1 LEZIONE VI MECCANISMI DI CONTROLLO TRASCRIZIONALI E TRADUZIONALI Dott. Paolo Cascio

2 Un principio fondamentale della biologia molecolare della cellula è: Le azioni e le proprietà di ogni tipo di cellula sono determinate dalle proteine che essa contiene NELLE VARIE CELLULE DEVONO PERTANTO ESISTERE DEI COMPLESSI MECCANISMI MOLECOLARI CHE REGOLANO IL NUMERO DELLE DIVERSE PROTEINE. IN E. COLI, AD ESEMPIO, LE QUANTITA DELLE DIVERSE PROTEINE VARIANO DA MENO DELLO 0.1% A PIU DEL 2% DEL TOTALE, A SECONDA DELLA LORO FUNZIONE E QUESTO ANCHE SE CIASCUNA PROTEINA E CODIFICATA DA UN SOLO GENE. POSSIAMO IMMAGINARE DIVERSE MODALITA MEDIANTE LE QUALI LA CELLULA EFFETTUA QUESTA SINTESI DIFFERENZIALE: 1. REGOLAZIONE DELLA VELOCITA CON CUI LE MOLECOLE DI mrna VENGONO TRASCRITTE (CONTROLLO TRASCRIZIONALE). 2. REGOLAZIONE DELLA VELOCITA CON CUI LE MOLECOLE DI mrna VENGONO DEGRADATE.

3 3. REGOLAZIONE DELLA VELOCITA CON CUI LE MOLECOLE DI mrna VENGONO TRADOTTE NELLE PROTEINE (CONTROLLO TRADUZIONALE). 4. REGOLAZIONE DELLA VELOCITA CON CUI LE PROTEINE VENGONO DEGRADATE (CONTROLLO DEGRADATIVO). I meccanismi 1 e 2 determinano l abbondanza dei singoli mrna nella cellula. CONTROLLO TRASCRIZIONALE L RNA-POLIMERASI SI LEGA AD UN SITO DETTO PROMOTORE. L EFFICIENZA CON CUI HA INIZIO LA TRASCRIZIONE VARIA CONSIDEREVOLMENTE A SECONDA DELLA FORZA DEL PROMOTORE (CHE DIPENDE DALLA SEQUENZA DELLE SUE BASI). AD ESEMPIO, IN E. COLI CERTI GENI VENGONO TRASCRITTI OGNI DUE SECONDI (QUINDI HANNO PROMOTORI MOLTO FORTI) MENTRE ALTRI SOLO UNA VOLTA OGNI 40 MINUTI (QUINDI HANNO PROMOTORI MOLTO DEBOLI).

4 CONFRONTANDO LE SEQUENZA CHE PRECEDONO IL SITO D INIZIO DELLA TRASCRIZIONE DI MOLTI GENI PROCARIOTI E POSSIBILE EVIDENZIARE LE SEQUENZE-CONSENSO DEI PROMOTORI. SOLO POCHISSIMI GENI HANNO PROMOTORI CHE CORRISPONDONO ESATTAMENTE ALLE SEQUENZE-CONSENSO. IN MOLTO CASI, IN PARTICOLARE NELLA SEQUENZA TATA, ALCUNE BASI A E T SONO SOSTITUITE DA G E C (E IN QUESTO CASO IL PROMOTORE E PIU DEBOLE). UN PROMOTORE E TANTO PIU FORTE QUANTO PIU SI AVVICINA ESATTAMENTE ALLA SEQUENZA CONSENSO. IN GENERALE I BATTERI VIVONO IN AMBIENTI CHE CAMBIANO RAPIDAMENTE E DI CONSEGUENZA DEVONO POTER MODIFICARE MOLTO RAPIDAMENTE LE CONCENTRAZIONI INTRACELLULARI DI MOLTI ENZIMI METABOLICI. QUESTE MODIFICAZIONI AVVENGONO MEDIANTE MECCANISMI DI CONTROLLO TRASCRIZIONALI. UN ESEMPIO BEN STUDIATO DI CONTROLLO TRASCRIZIONALE E QUELLO DELL OPERONE DEL LATTOSIO (OPERONE LAC) IN E. COLI.

5 PER POTER UTILIZZARE COME NUTRIENTE IL LATTOSIO E. COLI NECESSITA DI TRE ENZIMI: 1) β-galattosidasi: SCINDE IL LATTOSIO IN GLUCOSIO + GALATTOSIO. 2) PERMEASI: FACILITA L INGRESSO DEL LATTOSIO NEL BATTERIO. 3) TIOGALATTOSIDE TRANSACETILASI: ELIMINA COMPOSTI SIMILI AL LATTOSIO CHE NON POSSONO ESSERE USATI COME NUTRIENTI. QUANDO NEL MEZZO DI COLTURA NON E PRESENTE IL LATTOSIO I LIVELLI CITOPLASMATICI DEI TRE ENZIMI SONO ESTREMAMENTE BASSI. NON APPENA VIENE AGGIUNTO DEL LATTOSIO, PERO, I LORO LIVELLI AUMENTANO NOTEVOLMENTE, PERCHE AUMENTA ENORMEMENTE LA SINTESI DEI RISPETTIVI mrna. IL LATTOSIO AGISCE QUINDI DA INDUTTORE.

6 MECCANISMO D AZIONE DEL LATTOSIO: 1) ESISTE UNA MOLECOLA AVENTE FUNZIONE DI REPRESSORE SPECIFICO CHE LEGANDOSI IN PROSSIMITA DELL INIZIO DEL GENE DELLA β-galattosidasi (IN UN SITO DENOMINATO OPERATORE) IMPEDISCE ALL RNA POLIMERASI DI INIZIARE LA SINTESI DELL mrna. 2) IL LATTOSIO AGISCE COME UN INDUTTORE POICHE LEGANDOSI AL REPRESSORE GLI IMPEDISCE DI LEGARSI ALL OPERATORE. IN PRESENZA DEL LATTOSIO IL REPRESSORE VIENE QUINDI INATTIVATO E CIO CONSENTE LA SINTESI DELL mrna. I GENI DEI TRE ENZIMI VENGONO TRASCRITTI IN UN UNICO mrna POLICISTRONICO. NEI PROCARIOTI I GENI ADIACENTI CHE VENGONO TRASCRITTI IN UN UNICA MOLECOLA DI mrna E LE LORO REGIONI DI CONTROLLO VENGONO DENOMINATI OPERONI. LE SEQUENZE DI DNA SU CUI SI FISSANO I REPRESSORI SONO CHIAMATE OPERATORI. L OPERONE LAC HA DUE OPERATORI: O1 E O2.

7 LA PRESENZA DEL REPRESSORE LAC NON IMPEDISCE IL LEGAME DELL RNA-POLIMERASI AL PROMOTORE, MA ANZI LA FACILITA, PER CUI NON APPENA IL REPRESSORE VIENE RIMOSSO LA POLIMERASI PUO INIZIARE A TRASCRIVERE L RNA. L AFFINITA DEL REPRESSORE LAC PER O1 E CIRCA 10 9 VOLTE MAGGIORE DI QUELLA PER UNA SEQUENZA QUALSIASI DI DNA. IL REPRESSORE LAC PRENDE CONTATTO CON UN PUNTO QUALSIASI DEL DNA E POI SCORRE LUNGO L α-elica FINO A QUANDO NON TROVA L OPERATORE. IN UNA CELLULA BATTERICA CI SONO CIRCA 10 MOLECOLE DI REPRESSORE LAC, MA QUESTO TROVA COSI RAPIDAMENTE O1 CHE QUANDO SI DISSOCIA SPONTANEAMENTE DA ESSO, UN ALTRO REPRESSORE OCCUPA O1 NEL GIRO DI 2 MINUTI E MEZZO (E IN QUESTO INTERVALLO DI TEMPO PROBABILMENTE NON SARA AVVIATA PIU DI UNA SINGOLA TRASCRIZIONE).

8 IL DOMINIO N-TERMINALE DEL REPRESSORE LAC SI INSERISCE NEL SOLCO MAGGIORE DEL DNA E SI LEGA IN MANIERA ALTAMENTE SPECIFICA CON ALCUNE COPPIE DI BASI DELLA SEQUENZA O1. LA MAGGIOR PARTE DEI REPRESSORI BATTERICI NOTI AGISCONO COME OMODIMERI. IN GENERALE UNA α-elica DI OGNI MONOMERO SI INSERISCE NEL SOLCO MAGGIORE DEL DNA A LIVELLO DELL OPERATORE. Modello del repressore del batteriofago 434. Notare i residui di Glutammato (Q), Serina (S) e Treonina (T) che formano legami H con basi specifiche nel solco maggiore del DNA dell operatore. UN SINGOLO MONOMERO DEL REPRESSORE INTERAGISCE IN MODO TROPPO DEBOLE CON IL DNA PER LEGARSI STABILMENTE AD ESSO. TUTTAVIA UN REPRESSORE DIMERICO AVRA IL DOPPIO DELLE INTERAZIONI DI UN MONOMERO, IL CHE SARA SUFFICIENTE PERCHE I REPRESSORI SI POSSANO LEGARE AI LORO OPERATORI CON ALTA AFFINITA.

9 OGNI REPRESSORE VIENE CODIFICATO DA UN GENE SPECIFICO. IL GENE DEL REPRESSORE DEL LATTOSIO SI TROVA IMMEDIATAMENTE A MONTE DELL OPERONE, MA IN ALTRI CASI IL GENE DEL REPRESSORE E AMPIAMENTE SEPARATO DAI GENI DELL OPERONE SUI QUALI AGISCE. NORMALMENTE LA VELOCITA CON CUI VENGONO SINTETIZZATI I REPRESSORI NON CAMBIA (SINTESI COSTANTE). GENERALMENTE I PROMOTORI DEI GENI DEI REPRESSORI SONO PIUTTOSTO DEBOLI, PER CUI SONO POCHE LE MOLECOLE DI REPRESSORE PRESENTI NELLA CELLULA. POICHE UN REPRESSORE IMPEDISCE ALL RNA POLIMERASI DI SVOLGERE LA PROPRIA FUNZIONE (CIOE DI SINTETIZZARE L mrna), ESSO OPERA UN CONTROLLO NEGATIVO SULLA TRASCRIZIONE. I PROMOTORI, PERO, POSSONO ANCHE ESSERE SOGGETTI ALL AZIONE DI EFFETTORI POSITIVI CHE AUMENTANO LA VELOCITA DI SINTESI DELL mrna. QUESTI ELEMENTI REGOLATORI POSITIVI AGISCONO FAVORENDO IL LEGAME DELL RNA POLIMERASI AL PROMOTORE E LA SEPARAZIONE DELLE DUE CATENE DI DNA A LIVELLO DEL PROMOTORE.

10 UN ESEMPIO BEN COMPRESO DI REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE POSITIVA RIGUARDA SEMPRE L OPERONE LAC. NELLE CELLULE BATTERICHE CHE CRESCONO IN PRESENZA DI GLUCOSIO I LIVELLI INTRACELLULARI DI AMP CICLICO (camp) SONO MOLTO BASSI E DI CONSEGUENZA LA PROTEINA-RECETTORE DEL camp (CRP) SI TROVA NELLA SUA FORMA INATTIVA, CHE NON PUO LEGARE IL DNA. SE, PERO, LA CELLULA SI TROVA IN CARENZA DI GLUCOSIO, COMINCIA A SINTETIZZARE camp NELLA FORMA NON LEGATA AL camp LA PROTEINA CRP NON RIESCE A INTERAGIRE CON IL DNA (LE α-eliche CHE POSSONO LEGARE IL DNA NON RIESCONO AD INSERIRSI NEL SOLCO MAGGIORE). SE, PERO, IL GLUCOSIO NELLA CELLULA DIMINUISCE, AUMENTA LA CONCENTRAZIONE DEL camp. IL camp PUO COSI LEGARSI AL CRP E DETERMINARE UNA MODIFICAZIONE DELLA CONFORMAZIONE DELLA PROTEINA CHE A QUESTO PUNTO PUO INSERIRE LE SUE α-eliche NEL SOLCO MAGGIORE DEL DNA. NELLA SUA FORMA ATTIVA CRP SI LEGA AD UNA SEQUENZA SPECIFICA VICINA AL PROMOTORE LAC. POICHE CRP HA ANCHE UN ALTRO SITO CHE LEGA L RNA POLIMERASI, LA SUA PRESENZA SUL DNA FACILITA IL LEGAME DEL RNA POLIMERASI CON IL PROMOTORE E IN QUESTO MODO RENDE PIU VELOCE L INIZIO DELLA TRASCRIZIONE.

11 OPERONE DEL TRIPTOFANO E COSTITUITO DA UNA REGIONE DI CONTROLLO TRASCRIZIONALE E DA CINQUE GENI CHE CODIFICANO PER GLI ENZIMI IMPLICATI NELLE ULTIME TAPPE DELLA BIOSINTESI DEL TRIPTOFANO. LA VELOCITA D INIZIO DELLA TRASCRIZIONE DELL mrna DELL OPERONE TRP E CONTROLLATA DA UNA MOLECOLA DI REPRESSORE ATTIVATA DAL TRIPTOFANO. IN PRESENZA DI ELEVATI LIVELLI INTRACELLULARI DI TRIPTOFANO QUESTO AMINOACIDO SI LEGA AL REPRESSORE MODIFICANDONE LA STRUTTURA TRIDIMENSIONALE IN MODO CHE ESSO A SUA VOLTA POSSA LEGARSI ALL OPERATORE DELL OPERONE IMPEDENDO ALLA RNA POLIMERASI DI AGIRE. QUESTO, PERO, NON E IL SOLO MECCANISMO DI CONTROLLO DI QUESTO OPERONE. INFATTI, IN PRESENZA DI ELEVATI LIVELLI DI TRIPTOFANO, SPESSO LA TRASCRIZIONE INIZIA MA SI FERMA QUASI SUBITO. COSI INVECE DI PRODURRE GLI mrna DEI 5 ENZIMI NECESSARI PER SINTETIZZARE IL TRIPTOFANO, SI FORMA SOLO L mrna PER UNA PROTEINA LEADER DETTA TRP L. QUESTA PROTEINA NON HA UNA FUNZIONE SPECIFICA,

12 MA HA LA CARATTERISTICA DI ESSERE RICCA DI RESIDUI DI TRIPTOFANO. QUESTO MECCANISMO DI CONTROLLO TRASCRIZIONALE PRENDE IL NOME DI ATTENUAZIONE (NEL SENSO DI ACCORCIAMENTO ). UN SITO DI ATTENUAZIONE, IN PRATICA, E UNA SEQUENZA DI DNA DOVE L RNA POLIMERASI PUO SCEGLIERE DI CONTINUARE O INTERROMPERE LA TRASCRIZIONE. LA POSSIBILITA CHE L ATTENUAZIONE SI REALIZZI O MENO DIPENDE DALLA PRECISA STRUTTURA DEL RIPIEGAMENTO DELL mrna NASCENTE NEL TRATTO COMPRESO FRA L RNA POLIMERASI CHE LO STA SINTETIZZANDO E IL RIBOSOMA CHE STA TRADUCENDO LA REGIONE TRP L. INFATTI L mrna PER LA TRP L CONTIENE DEI TRATTI DI SEQUENZA CHE POSSONO APPAIARSI FRA LORO, FORMANDO L UNA O L ALTRA DI DUE DIVERSE STRUTTURE A FORCINA. ALTI LIVELLI DI TRIPTOFANO: IL RIBOSOMA TRADUCE VELOCEMENTE LA REGIONE DI TRP L E L mrna NASCENTE SI RIPIEGA IN UNA STRUTTURA CHE SEGNALA ALL RNA POLIMERASI DI CESSARE LA TRASCRIZIONE (ansa a forcina seguita da regione ricca di U). BASSI LIVELLI DI TRIPTOFANO: IL RIBOSOMA TRADUCE MOLTO LENTAMENTE LA REGIONE DI TRP L (PERCHE I TRIPTOFANIL-tRNA SONO MOLTO SCARSI) E L mrna NASCENTE SI RIPIEGA IN UNA

13 STRUTTURA ALTERNATIVA CHE NON SEGNALA ALL RNA POLIMERASI DI TERMINARE LA TRASCRIZIONE. POICHE I PROMOTORI REGOLANO LA TRASCRIZIONE SOLO DI TRATTI DI DNA AD ESSI IMMEDIATAMENTE ADIACENTI, ESSI VENGONO DEFINITI COME ELEMENTI REGOLATORI CHE AGISCONO IN CIS. I REPRESSORI, AL CONTRARIO, NON AGISCONO SOLO IN PROSSIMITA DEL GENE CHE LI CODIFICA (MA A LIVELLO DI TUTTO IL DNA) E PER QUESTA RAGIONE VENGONO DEFINITI ELEMENTI REGOLATORI CHE AGISCONO IN TRANS. CONTROLLO TRADUZIONALE LA SINTESI DELLE PROTEINE NEI PROCARIOTI VIENE CONTROLLATA ANCHE A LIVELLO TRADUZIONALE. L EFFICIENZA DELL INIZO DELLA TRADUZIONE DIPENDE DALLA PRESENZA DI UNA SEQUENZA RICCA DI PURINE (6-8 NUCLEOTIDI) SUBITO A MONTE DEL CODONE D INIZIO AUG. QUESTA SEQUENZA E COMPLEMENTARE AD UNA SEQUENZA PRESENTE ALL ESTREMO 3 DELL rrna 16S DEI RIBOSOMI. IL CORRETTO POSIZIONAMENTO DEL RIBOSOMA SULL mrna (EVENTO

14 INIZIALE DELLA TRADUZIONE) RICHIEDE L APPAIAMENTO FRA LE BASI DELL rrna 16S E QUELLE DELL mrna (DETTE SEQUENZE DI SHINE- DALGARNO). GENERALMENTE GLI mrna CHE VENGONO TRADOTTI CON MAGGIOR EFFICIENZA HANNO LA SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO SITUATA 8 NUCLEOTIDI A MONTE DEL CODONE D INIZIO. MUTAZIONI CHE SPOSTANO LA SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO PIU VICINA O PIU LONTANA AL CODONE D INIZIO DIMINUISCONO FORTEMENTE L EFFICIENZA DELLA TRADUZIONE DELL mrna. L AZIONE DELLE SEQUENZE DI SHINE-DALGARNO PUO ESSERE MODULATA DA PARTE DI PROTEINE CHE SI LEGANO AD ESSE E LE RENDONO NON ACCESSIBILI AI RIBOSOMI. UN ESEMPIO DI TALE MECCANISMO DI REGOLAZIONE RIGUARDA LE PROTEINE RIBOSOMIALI (R-PROTEINE) IN E. COLI. QUANDO LA VELOCITA DI SINTESI DELLE R-PROTEINE E SUPERIORE A QUELLA CON CUI VIENE PRODOTTO L rrna LE R-PROTEINE LIBERE SI ACCUMULANO E ALCUNE DI ESSE (PROTEINE CHIAVE ) SI LEGANO ALLE SEQUENZE DI SHINE-DALGARNO PRESENTI SULLE MOLECOLE DELL mrna CHE CODIFICA PER LE R-PROTEINE STESSE.

15 IN QUESTO MODO LE R-PROTEINE NON VENGONO MAI PRODOTTE CON VELOCITA SUPERIORE A QUELLA CON CUI POSSONO ESSERE IMPIEGATE PER COSTRUIRE I RIBOSOMI. QUESTO E UN ESEMPIO DI CONTROLLO TRADUZIONALE, PERCHE AVVIENE A LIVELLO DELLA TRADUZIONE DELL mrna IN PROTEINE. NEL GENOMA DI E. COLI I GENI CHE CODIFICANO GRUPPI DIFFERENTI DI R-PROTEINE SONO CONTENUTI IN UN CERTO NUMERO DI OPERONI DIFFERENTI. CIASCUN OPERONE CODIFICA LA PROPRIA SPECIFICA PROTEINA CHIAVE CHE INIBISCE L ESPRESSIONE DELL INTERO OPERONE. LE R-PROTEINE CHIAVE SI LEGANO MOLTO PRECOCEMENTE ANCHE ALL rrna NEL CORSO DELL ASSEMBLAGGIO DEL RIBOSOMA. LE SEQUENZE DELL rrna CHE LEGANO QUESTE PROTEINE SONO DEL TUTTO SIMILI ALLE SEQUENZE DI SHINE-DALGARNO DELL mrna PER LE R-PROTEINE. IL CONTROLLO TRADUZIONALE RAPPRESENTA PERTANTO UNA COMPETIZIONE TRA L rrna E L mrna PER LE R- PROTEINE NEI CONFRONTI DI QUESTE PROTEINE CHIAVE.

16 CONTROLLO TRADUZIONALE NEGLI EUCARIOTI Anche nelle cellule eucariotiche sono noti alcuni meccanismi di controllo traduzionale. Uno di questi riguarda la traduzione dell mrna per la ferritina. Ferritina proteina intracellulare che lega gli ioni ferro impedendo così l accumulo tossico di ioni Fe liberi. Fe intracellulare scarso Scarsa sintesi di ferritina Il Fe presente si lega agli enzimi che ne necessitano Fe intracellulare in eccesso Elevata sintesi di ferritina Il Fe in eccesso viene sequestrato dalla ferritina. La sintesi della ferritina viene regolata a livello traduzionale. Tale regolazione dipende dalla presenza degli elementi di risposta al ferro (IRE) situati nella regione 5 non tradotta (5 UTR = Untranslated region) dell mrna della transferrina.

17 Ciascun IRE forma una struttura a stelo ed ansa alla quale si lega la proteina di legame per l IRE (IRE-BP). Molto Fe Fe-IRE-BP Fe-IRE-BP non si lega agli IRE Traduzione Poco Fe IRE-BP IRE-BP si lega agli IRE Blocco Traduzione La traduzione viene impedita perché IRE-BP impedisce l aggancio dei ribosomi all mrna.