differente ripartizione delle sostanze tra due fasi immiscibili

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1 Cromatografia Dal greco chroma: colore, graphein: scrivere 1903 Mikhail Twsett E il termine generico che indica una serie di tecniche di separazione di molecole (anche molto simili in base alle loro proprietà chimiche e fisiche). Si basa sulla differente ripartizione delle sostanze tra due fasi immiscibili

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4 Poiché le proteine assorbono la luce a l = 280 nm, il detector può anche essere semplicemente un sistema ottico che consente di monitorare la grandezza A 280nm cromatogramma A 280 Tempo o volume di eluizione

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6 Il coefficiente di ripartizione descrive il modo in cui un composto si distribuisce tra due fasi immiscibili [x] fase A / [x] fase B = K d K d è una costante ad una data temperatura Il tempo di ritenzione t R descrive il tempo che un composto impiega per attraversare una colonna cromatografica e dipende dal tempo morto t M che occorre alla fase mobile (o a un soluto non trattenuto) per passare attraverso la colonna e dal tempo netto di ritenzione t R in cui il composto viene trattenuto dalle interazioni con la matrice della fase solida t R = t R + t M Il volume di eluzione (o di ritenzione) corrisponde al volume di fase mobile richiesto per eluire una molecola

7 L efficienza di una cromatografia, cioè la sua capacità di separare componenti con proprietà diverse, dipende da : 1. Fattore di capacità k definito come il tempo relativo che occorre ad un componente per eluire in relazione ad un altro componente che non interagisce con la matrice. k dipende a sua volta da K d e dalla lunghezza della colonna A 280 t R3 t R2 t R1 tempo

8 L efficienza di una cromatografia, cioè la sua capacità di separare componenti con proprietà diverse, dipende da : 2. numero di piatti teorici N della colonna, che dipendono dalle proprietà geometriche della colonna (lunghezza, diametro) e dalla omogeneità della fase stazionaria (dimensioni e impaccamento della matrice), che influenzano la forma del picco in uscita. N = 1000 A 280 N = 100 N = 10

9 256 molecole di una sostanza con con K D =1 colonna con 5 piatti teorici I 256 II III IV V S: 128I M: 128 II III IV V S: M: 64 S: M: 64 I II III IV V S: 32 M: 32 S: 64 M:64 S: 32 M: 32 I II III IV V S: 16 M: 16 S: 48 M:48 S: 48 M:48 S: 16 M:16 I II III IV V S: 8 M: 8 S: 32 M: 32 S: 48 M: 48 S: 32 M: 32 S: 8 M: 8

10 256 molecole di una sostanza pura con K D =3 colonna con 5 piatti teorici I 256 II III IV S: 64 M: S: 16 I M: 48 S: 48 II 192 M:144 III IV I II III IV S: 4 M: 12 I S: 24 M:72 II S: 36 M: 108 III IV 4 S: 1 M: 3 S: 9 36 M:27 S: M:81 S: M:81 I II III IV V V V V V 81

11 Confrontiamo: I 16 I 1 II 64 II 12 III 96 III 54 IV 64 IV 108 V 16 V 81 K D =1 K D =3

12 La bontà di uno specifico sistema cromatografico si giudica in base al grado di risoluzione ottenuto (larghezza e vicinanza dei picchi) e dipende dai seguenti parametri: selettività: è la capacità di un sistema cromatografico (fase stazionaria + fase mobile) di discriminare tra due composti strutturalmente correlati e si misura come rapporto tra i tempi di ritenzione; efficienza: è la misura degli effetti di diffusione che provoca allargamento dei picchi e la loro sovrapposizione; capacità: è la misura della quantità di materiale che può essere risolto senza sovrapposizione dei picchi.

13 Tipi di cromatografia Cromatografia di ripartizione Cromatografia su strato sottile (TLC) Cromatografia su carta Cromatografia su colonna Gel-filtrazione Affinità A scambio ionico FPLC HPLC GLC Cromatografia di adsorbimento

14 Cromatografia su colonna 1. Preparazione della colonna (idratazione e impaccamento) 3. Applicazione del campione da purificare Metodo "dry" (colonna è riempita con la fase stazionaria in polvere e viene quindi idratata con la fase mobile) Metodo "wet" (colonna è riempita con la fase stazionaria gelatinosa in quanto già idratata con la fase mobile) 4. Separazione del campione tramite aggiunta di fase mobile (i modi di eluire il campione sono diversi a seconda del tipo di cromatografia su colonna) 2. Equilibratura della colonna con la fase mobile (almeno 5 vv il vol della fase stazionaria)

15 Cromatografia per gel filtrazione DIMENSIONI -stesso tampone per equilibrare (stessa composizione fase mobile all interno ed esterno delle sfere) ed eluire -per proteine globulari incide: il pm, comprese le molecole di solvatazione -per proteine con stesso pm, incide la forma -colonne lunghe e strette (dipendenza dal volume), ma lunghezza controllata -incidono modificazioni posttraduzionali e struttura quaternaria

16 Cromatografia per gel filtrazione Fase stazionaria : granuli di gel (polisaccaridi insolubili) Fase mobile: solventi acquosi Uso comune: separazione di proteine o acidi nucleici

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19 Il grafico dell assorbanza in funzione del tempo o del volume di eluizione si chiama cromatogramma

20 Esiste una proporzionalità inversa tra volume di eluizione e massa molecolare Si può costriuire una curva di calibarzione per determinare il peso di una proteina sarebbe il volume di eluizione relativo: Ve/Vo (Vo=1/3Ve)

21 Si può usare per separare non solo proteine, ma anche acidi nucleici, polisaccaridi, virus, ormoni, Inoltre può servire per purificare macromolecole da molecole piccole (ad es. sali quali il solfato d ammonio e solvento organici quali il fenolo) Possiblita di riusare la resina

22 Cromatografia a scambio ionico Come gli aminoacidi, anche le proteine hanno un punto isolettrico In base al loro punto isoelettrico ed al ph della soluzione, alcune proteine si comportano come anioni, altre come cationi ed altre ancora sono neutre. In base questo possono essere separate per cromatografia

23 Cromatografia a scambio ionico INTERAZIONI TRA MOLECOLE DI CARICA OPPOSTA -colonna impaccata con una resina scambiatore di ioni -proteine neutre o con stessa carica dello scambiatore vengono eluite -permette la separazione di proteine con differenze di pi fino a 0.5

24 Scambiatori CATIONICI (scambiatori acidi) ANIONICI (scambiatori basici)

25 Equilibratura della resina Sono parametri critici per equilibrare la resina: -il ph -la forza ionica Equilibratura è ottimale quando entrambi hanno il medesimo valore del tampone anche all eluizione (ossia non vengono modificati dalla resina). Tampone per equlibrare deve essere a bassa forza ionica (5-20 mm) Il suo ph è spesso vicino alla neutralità Applicazione del campione da purificare (da far legare alla resina) Campione disciolto nello stesso tampone in cui è stata equilibrata la resina viene fatto penetrare nella resina. Si lava più volte la resina con il tampone di equilibratura, finchè non escono più proteine Eluizione del campione -Variare il ph (entro un certo limite) -Aumentare la forza ionica gradiente

26 Protein pi=5.5 Equilibration buffer: ph 7.2 low salt Prot Elution buffer: ph 6,8 high salt Protein pi=8 Equilibration buffer: ph 7.2 low salt Prot + Elution buffer: ph 7,8 high salt

27 Individuazione delle frazioni contenenti l enzima da purificare A 280 Attività enzimatica n frazione

28 Cromatografia per affinità INTERAZIONI SPECIFICHE (no proprietà fisicochimiche) -purificazione completa di una proteina in una singola tappa (ligando: anticorpo, inibitore di un enzima, ligando di un recettore) o di una classe di proteine (ligando: nucleotidi, avidina, proteine A e G, ) -legame stabile tra ligando e resina e reversibile tra ligando e macromolecola da separare

29 Cromatografia per affinità Fase stazionaria : granuli di resina coniugata al ligando Fase mobile: solventi acquosi Uso comune: separazione di proteine molecola A Ligando specifico per la molecola A Altre molecole non affini al ligando

30 Ligandi comunemente usati in cromatografia per affinità : Anticorpi specifici Proteina A o G Substrati Cofattori Metalli L eluizione della proteina legata può avvenire per competizione (aggiunta di ligando libero) o variando le condizioni di forza ionica o di ph o di temperatura

31 Esempio: ligando-recettore

32 Esempio: enzima-inibitore

33 Esempio: antigene-anticorpo not

34 Esempio: antigene-anticorpo tramite proteina A/G

35 Esempio: antigene-anticorpo tramite proteina A/G e beads magnetiche

36 Esempio: legame avidina-biotina

37 Esempio: IMAC (immobilized metal ion affinity chromatography) Eluizione con imidazolo che compete con le istidine per l interazione con lo ione metallico

38 Esempio: purificazione di mrna

39 Cromatografia di ripartizione (liquido/liquido) Cromatografia su carta

40 Migrazione del solvente per capillarità origine

41 Cromatografia di ripartizione (liquido/liquido) Cromatografia su strato sottile (TLC-thin layer chromatography) Fase stazionaria : piastrine di vetro rivestite di cellulosa o silice (supporto) solventi polari o apolari Fase mobile: solventi organici o polari Uso comune: separazione di lipidi o piccole molecole (rilevazione con colorazione)

42 TLC bidimensionale

43 Cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC) Utilizza i principi della cromatografia di ripartizione, a scambio ionico, gel filtrazione L alta pressione consente di utilizzare matrici estremamente fini e di aumentare il numero di piatti teorici. Consente di analizzare quantitativamente e qualitativamente miscele di piccole molecole, rispetto a composti di riferimento

44 -Colonne di acciaio INOX di l cm; d 1-4 mm -Solventi PURI e DEGASSATI -Sistema di rivelazione: spettrofotometro/ fluorimetro/spettrometro di massa -Collettore di frazioni automatico

45 Vantaggi : Velocità di esecuzione Riproducibilità della separazione Semi-automaticità del procedimento Svantaggi : Costo degli apparati e delle colonne Utilizzabile per analisi o in purificazioni su piccola scala di laboratorio

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47 Cromatografia liquida veloce di proteine (FPLC) -Purificazione di proteine - stessi principi della cromatografia classica - pressioni mediamente elevate - funzioni preparative e analitiche

48 Cromatografia gas-liquido (GLC) -Tecnica analitica -Consente di analizzare quantitativamente e qualitativamente miscele di molecole piccole a bassa polarità, rispetto a composti di riferimento -Fase stazionaria: liquida -Fase mobile: gas (inerte) -Principio: ripartizione/adsorbimento

49 Vantaggi : Elevata sensibilità Riproducibilità della separazione Semi-automaticità del procedimento Svantaggi : Costo degli apparati e delle colonne Utilizzabile per analisi Non consente purificazione, poiché il campione viene derivatizzato e vaporizzato prima della corsa e poi rivelato ad alte temperature