VALORE E LIMITI DEGLI ESAMI DI LABORATORIO

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1 VALORE E LIMITI DEGLI ESAMI DI LABORATORIO La Biochimica Clinica studia direttamente il metabolismo degli organi in vivo (cervello, muscolo scheletrico, prostata, miocardio) e campioni biologici provenienti dall uomo ex vivo (fluidi biologici, liquidi biologici, biopsie). Tutto questo con finalità diagnostiche o finalità di screening. Finalità diagnostiche: Confermare / escludere una diagnosi Valutare la gravità di una patologia Finalità di screening: Monitoraggio di una terapia Monitorare progressione / remissione di una malattia Individuare patologie non sospettate o ancora silenti Screening neonatale Screening oncologico: i markers possono essere sostanze specifiche del tumore o l'aumento di un metabolita prodotto dal tessuto sano 1. Test mirati 2. Profili metabolici generali 3. Prove di funzionalità dinamica Raccomandazioni del NCCLS (National Commettee for Clinical Laboratory Standard) per la raccolta dei campioni 1. Preparazione e individuazione del paziente 2. Preparazione del punto di prelievo 3. Scelta del tipo di campione 4. Condizioni ambientali 5. Procedura di raccolta e prelievo 6. Contenitori 7. Additivi 8. Etichettatura e codifica 9. Condizioni di conservazione 10. Pericoli per la salute Richiedere un test di laboratorio profili diagnostici allargati: funzionalità epatica, funzionalità renale, funzionalità asse ipofisi-ipotalamo-surrene test diagnostici mirati: di prima istanza, di approfondimento, decorso della patologia, controllo della terapia Conoscere quali informazioni ottenere da ogni indagine di laboratorio Interpretare il risultato di un test di laboratorio Variabilità del test I risultati di laboratorio sono delle stime del valore della grandezza o della proprietà, non risposte sicure e veritiere; in particolare, si deve considerare l esistenza di variabilità biologica: influenze genetiche, influenze fisiologiche a lungo termine (età, sesso, razza, fattori ambientali e climatici, obesità, stato nutrizionale, stile di vita, gravidanza), influenze fisiologiche a breve termine (cibo, fumo, alcool, caffè, postura, veglia e sonno, movimento, esercizio fisico, altitudine, ecc), risposte fisiopatologiche generali dell organismo (febbre, shock, trauma, stress, dolore, ansia), assunzione di sostanze estranee all organismo (farmaci, droghe d abuso) 1

2 inter-individuo (influenze genetiche, ambientali, età, sesso) intra-individuo (assunzione di sostanze o farmaci, variabilità biologica intrapersonale ritmica: ad esempio, la secrezione di talune sostanze segue un ritmo circadiano o circamensile, con andamento periodico che presenta un acrofase, ovvero distanza di tempo tra il punto più alto e il punto di partenza, e un mesor, media fra il livello più alto e quello più basso; conseguentemente anche gli effetti sull organismo seguiranno tale ritmo.) analitica, relativa cioè al laboratorio: può essere a causa della consegna di un campione incongruo (ad esempio plasma aggiunto di anticoagulante quando serviva del siero: la valutazione della coagulazione non potrà essere effettuata), oppure per errori intrinseci delle metodiche diagnostiche: pre-analitica: riguarda la raccolta e la conservazione del campione biologico; es. mancato rispetto delle condizioni ottimali per la raccolta dell analita (nel caso di un prelievo venoso, il digiuno dovrà essere di almeno 6-8 ore, ma non di più di 16; se si è effettuata attività fisica nelle 10 ore precedenti potranno esservi alterazioni dell LDH e delle transaminasi; la postura influenza svariate indagini, si consideri che in un pz. allettato vi sarà il 10% di liquidi nel circolo in più. In caso di prelievo, ad esempio, un ago troppo sottile potrà causare emolisi). post-analitica: riguarda la conservazione del materiale. intra-analitica: dovuta ad errori relativi al metodo utilizzato. Il metodo è il maggior fattore di discordanza tra il valore reale e la sua stima, ed è imprescindibile dalle misure di posizione (media, mediana e moda). Variabilità Biologica + Variabilità Analitica = Coefficiente di Variazione Se uno stesso campione è analizzato diverse volte si otterranno sempre valori discordanti. Questo dipende da due fattori: La precisione è il grado di concordanza tra le diverse misure di uno stesso campione. Se una misura è precisa, allora i risultati ottenuti possono essere disposti secondo una variabilità continua (curva Gaussiana). Il coefficiente di variazione esprime di quanto i valori ottenuti discordano dalla media C.V. = D.S. μ 100 La precisione è influenzata dall errore casuale (ovvero incontrollabile) e, per questo, i risultati ottenuti avranno grado di errore diversi (alcuni sovrastimano il risultato, altri lo sottostimano). L accuratezza invece definisce il grado di concordanza tra un valore ottenuto ed il valore vero del campione. Anche l accuratezza è un concetto teorico: per quantificarlo ci si riferisce all inaccuratezza, definita come la discordanza tra il valore reale (o meglio, il valore più probabile del campione, ottenuto tramite misurazione con metodica Gold Standard) e la media dei valori ottenuti tramite misurazioni con il metodo in esame. L inaccuratezza è dovuta all errore sistematico (differenza numerica tra la media di un insieme di misure ripetute e il valore vero. Questa differenza, positiva o negativa, può essere espressa nelle unità in cui la grandezza è misurata, o come percentuale del valore vero. Il test produrrà risultati precisi ma inaccurati: in caso cioè di diverse valutazioni di uno stesso caso, si avranno risultati vicini tra loro ma distanti dal valore reale) dovuto ad es. ad errata taratura degli strumenti. Con questo tipo di errore, tutte le misurazioni presentano lo stesso grado di errore (tutti sovrastimano o tutti sottostimano il campione). Altri parametri che possono influenzare l efficacia di una misurazione sono la sensibilità e la specificità analitiche (diverse da sens. e spec. diagnostiche): la sensibilità analitica è la capacità del metodo di rilevare anche bassissime concentrazioni di analita; è importante quando, ad esempio, l analita da dosare è presente nell ordine dei 2

3 nanogrammi (es. ormoni); oppure quando anche piccole variazioni della concentrazione sono clinicamente significative (es. nelle talassemie). la specificità analitica è invece la capacità del metodo di rilevare soltanto l analita di interesse, e non sostanza simili ma pur sempre diverse. La specificità analitica è inficiata dall interferenza, fenomeno in cui sostanze simili all analita di interesse modulano il risultato dell esame. Si definisce matrice tutto ciò che è presente nel mezzo d esame che non sia l analita di interesse. Il Traguardo Analitico (rapporto tra variabilità analitica e variabilità biologica), in conclusione, è quello di ottenere una variabilità analitica che sia la metà di quella biologica (proprio perché la variabilità biologica non può essere eliminata). In questo modo, la variabilità analitica influirà per meno del 12% sul risultato finale dell esame: C.V. anal C.V. biol 2 C.V. tot = C.V. anal ² C.V. biol ² Differenza critica: massima differenza imputabile all effetto combinato della variabilità analitica e della variabilità biologica a un livello di probabilità prescelto (in genere 0.95). È la differenza minima tra due valori che può essere considerata clinicamente significativa, ovvero maggiore di C.V. tot 2,77 % D cr = 2,77 V. anal ² V. biol ² Praticamente, indica il grado di differenza che deve esserci tra i due valori (di solito valori pre e post terapia di un analita) perché la differenza possa essere considerata sinonimo di modificazione dello stato di salute (es. per dimostrare che la terapia è efficace): se i valori registrati hanno una variabilità maggiore della differenza critica, sono da considerare significativi. Per ciascun esame di laboratorio è necessario stabilire l intervallo di riferimento, ovvero un intervallo di valori definiti normali. Media ± 1 deviazione standard: comprende il 68,27% della popolazione Media ± 2 deviazioni standard: 95,45% Media ± 3 deviazioni standard: 99,73% Ovviamente, aumentando il numero di deviazioni standard si aumenterà il numero delle persone considerate sane : diminuirà perciò la sensibilità del test (capacità di individuare i malati), aumentando invece la specificità (capacità di individuare i sani); ci sarà il rischio di falsi negativi ma non di falsi positivi; il contrario diminuendo il numero di deviazioni standard. Sensibilità: Se = Specificità: Spe = V Pos V Pos F Negat 100 V Negat V Negat F Pos 100 Potenza diagnostica (efficienza): Sens Spec 2 [se è <80% il test non è usato.] Valore predittivo positivo (VPP): percentuale di soggetti che, risultati positivi al test, abbia davvero la VP malattia: VPP = VP FP 100 Valore predittivo negativo (VPN): percentuale di soggetti che, risultati negativi al test, non abbia la VN malattia: VPN = VN FN 100 VPP e VPN sono influenzati dalla prevalenza della malattia: se una malattia è poco diffusa nella popolazione, avrà di partenza un Valore Predittivo Positivo basso. 3

4 ENZIMI SIERICI Si tratta di enzimi dispersi a seguito di danno cellulare; una minima concentrazione sierica è presente anche in condizioni normali per il fisiologico turn-over proteico, ma aumenti sostanziali sono sintomatici di patologie; gli unici enzimi fisiologicamente presenti nel siero sono infatti quelli della coagulazione. Non solo i danni acuti causano aumento degli enzimi, ma anche qualsiasi condizione che aumenti la massa delle cellule produttrici: neoplasie, aumento della massa muscolare o alcolismo fanno parte di questa categoria. La concentrazione sierica è proporzionale all entità del danno, e si valuta tramite l aumento dell attività enzimatica rispetto al livello normale. La valutazione dell attività va effettuata alle condizioni ottimali di temperatura e ph per ciascun enzima, con substrato nelle concentrazioni saturanti ed eventuali cofattori. Emivita di alcuni enzimi sierici (ore) LDH 5: 8-12 CK: 15 AST: ALT: LDH 1: ALP: 3-7 gg γ-gt: 3-7 gg Enzimi più frequentemente dosati Siero: di routine: AST (GOT), ALT (GPT), GGT, LDH + isoenzimi, CK + isoenzima MB, ALP + isoenzimi, ALP ossea spec., ACP, lipasi, AMS tot (amilasi) utilizzati meno frequentemente: 5 -N, leucina aminopeptidasi (LAP), colinesterasi, pseudocolinesterasi, lipasi routine in laboratori specializzati: LPL, angiotensin-converting enzyme (ACE), GDH, G-6-PD, ATPasi, aldolasi Tessuti (biopsie): complesso I, II, III, IV e V della catena respiratoria, glicogeno fosforilasi, PFK, enzimi della via glicolitica, enzima malico LDH: acido lattico acido piruvico (in presenza di NAD NADH) È presente in quasi tutti gli organi e tessuti, specialmente muscolo scheletrico, cervello, eritrociti, leucociti, rene, fegato, polmone, linfonodi, miocardio, piastrine; è un tetrametro costituito da due monomeri diversi, M (muscle) e H (heart): LDH1 (HHHH): 18 33%, è prevalente nel miocardio e nelle emazie. Presente anche nella corteccia renale e nel polmone. LDH2 (HHHM): 28 40%, è prevalente nel miocardio e nelle emazie, oltre ad essere presente in pancreas, corteccia renale, polmone e muscolo scheletrico. LDH3 (HHMM): %, è presente in milza, pancreas, tiroide, linfociti, polmoni, placenta, muscolo scheletrico. LDH4 (HMMM): 6 16%, si trova in in fegato e muscolo scheletrico, midollare renale, polmone e placenta. LDH5 (MMMM): 2 3%, è presente in fegato e muscolo scheletrico. Presente anche nella midollare renale, muscolo scheletrico e pancreas. Per distinguere le diverse isoforme si usa l elettroforesi; valori anomali di LDH1 e LDH2 si riscontrano nell'infarto miocardico e nell'anemia emolitica. In particolare il livello di LDH1, a seguito di infarto del miocardio, raggiunge il picco dopo 48 h e rimane alterato per 1-3 settimane: l inversione del rapporto 4

5 LDH1/LDH2 a favore di LDH1 (flip) è suggestiva di un evento ischemico importante al miocardio. LDH3 aumentato è in relazione con l'infarto polmonare mentre un maggiore quantitativo di LDH5 è caratteristico dell'epatite virale acuta. + Creatina kinasi: creatina + ATP fosfo-creatina + ADP + H La fosfocreatina funge da riserva energetica per il movimento muscolare iniziale, prima che la fosforilazione ossidativa entri in campo; si accumula ove vi sia necessità rapida di ATP: è un dimero dato da diversi monomeri, specifici dei vari tessuti: è presente in muscolo scheletrico (MM > 80%), miocardio (MB 20-40%), cervello (BB 90%), stomaco, vescica, colon, utero, prostata, intestino, rene, ma non nel fegato. Nel siero l'isoforma MM rappresenta il 94 96%, la MB 6-4 %, BB è assente o in tracce, a causa della barriera ematoencefalica. Essendo un enzima di diametro elevato, esce dalle cellule solo in caso di danni ingenti, come nella distrofia di Duchenne o nella insufficienza respiratoria muscolare. AST e ALT Sono dosabili in siero, bile, liquor, saliva. Alanina amino transferasi (ALT o GPT): Alanina + α-chetoglutarato Piruvato + Glutammato Emivita 17 ore. Presente nel citosol di fegato, miocardio, muscolo scheletrico, rene. La forma mitocondriale non è dosabile nel siero. Aspartico amino transferasi (AST o GOT): Aspartato + α-chetoglutarato Glutammato + Ossalacetato Emivita: 47 ore. Presente nel citosol di miocardio, muscolo scheletrico, rene; nel fegato è presente sia una forma citoplasmatica che mitocondriale (mast, 80% dell AST epatocitaria), dosabile nel siero. Un aumento è caratteristico delle epatopatie (elevato in epatite virale, necrosi tossica, insufficienza circolatoria con shock e ipossia; moderato per infarto polmonare, emolisi) o delle cardiopatie (insufficienza congestizia, infarto del miocardio, pericardite, miocardite). DANNO MIOCARDICO Comparsa Picco Scomparsa Mioglobina 2-4 h (elevato VPP) 6-9 h h CK MB 6-8 h h 3-4 gg LDH h h 7-10 gg Rilevante il flip LDH1/LDH2, che diventa >1. Distribuzione isoenzimi LDH: normale ( ), infarto acuto del miocardio ( ) 5

6 VALUTAZIONE DI LABORATORIO DELLE ALTERAZIONI MULTIDISTRETTUALI ASSOCIATE ALL ETILISMO ACUTO E CRONICO 1. Criteri diagnostici (OMS, DSM IV-TR) 2. Assorbimento e Metabolismo dell etanolo 3. Effetti tossici: metabolici, nutrizionali 4. Principali danni d organo 5. Diagnosi 1. Criteri diagnostici (OMS, DSM IV-TR) Si definisce alcolismo un disturbo comportamentale cronico che si manifesta con l ingestione ripetuta di bevande alcoliche in misura eccedente gli usi dietetici e sociali della comunità, e tale da interferire con la salute del bevitore e con le sue funzioni sociali ed economiche. (OMS). Nel DSM IV-TR (Manuale Statistico e Diagnostico delle Malattie Psichiatriche) si pone la differenza tra abuso e dipendenza: Abuso: modalità patologica d uso di una sostanza, che porta a menomazione o disagio clinicamente significativi ricorrenti in 12 mesi: incapacità ad adempiere i principali compiti connessi con il proprio ruolo a casa, sul lavoro, o a scuola; uso della sostanza in situazioni fisicamente rischiose (alla guida dell auto); ricorrenti problemi legali; persistenti o ricorrenti problemi interpersonali o sociali. Dipendenza: caratterizzata da tolleranza (bisogno di dosi notevolmente più elevate della sostanza per raggiungere l intossicazione o l effetto desiderato; effetto notevolmente diminuito con l uso continuativo della stessa quantità di sostanza) ed astinenza (condizione causata dalla cessazione (o riduzione) della sostanza, precedentemente assunta in modo massiccio e prolungato, tale da procurare una grave compromissione della propria funzione sociale o lavorativa); è identificata da tre o più delle seguenti ricorrenti in 12 mesi: assunzione di dosi sempre maggiori, presenza di desiderio persistente, investimento di molto tempo in attività volte a procurarsi la sostanza, assumerla e riprendersi dagli effetti, riduzione delle attività socio-lavorative, consapevolezza della problematica. I sintomi e i segni dell etilista acuto o cronico sono l ipotermia, la bradicardia, l ipotensione, l alitosi, il vomito, la diarrea e il tremore. Si considera rischioso per lo sviluppo di etilismo un consumo di alcol di gr/die per anni, considerando che una unità alcolica, 12 gr, è contenuta in un bicchiere di vino da 125 ml o in uno di birra da 330 ml, o in 40 ml di superalcolico. Un alcolemia > 80gr/dL è considerata stato di ebbrezza. Cofattori che influenzano la soglia patologica di assunzione di etanolo: sono la predisposizione genetica, il sesso (le donne sono più sensibili all effetto dell alcool, avendo una minore efficienza del sistema alcool-deidrogenasi), lo stato nutrizionale, la concomitanza di altri agenti epatolesivi. Si considera sicuro, con la certezza di mancato sviluppo di condizioni patologiche anche in soggetti predisposti, un consumo di alcool < 7gr/die. 2. Assorbimento e Metabolismo dell etanolo L'alcool etilico o etanolo (CH 3 -CH 2 -OH) è una molecola organica composta da un singolo gruppo idrossilico (OH) e da una corta catena alifatica con 2 atomi di carbonio. Possiede proprietà sia idrofile che lipofile pertanto è detto amfofilo. Assorbimento: avviene per il 95% nel tratto digerente (70% stomaco e 25% duodeno) La velocità di assorbimento è determinata da: 6

7 quantità di etanolo consumata concentrazione di etanolo nella bevanda velocità di consumo composizione del contenuto gastrico inalazione (l etanolo è volatile) La sua distribuzione nei tessuti è proporzionale al loro contenuto di H 2 O. La velocità di distribuzione dipende dal grado di vascolarizzazione: in organi con alto flusso sanguigno (Cervello, Fegato, Polmoni, Reni) l equilibrio avviene rapidamente; in organi con basso flusso sanguigno (muscolo), l equilibrio avviene lentamente. L etanolo attraversa la barriera placentare. Proprio la sua caratteristica amfofila permette alle molecole di raggiungere distretti molto vascolarizzati e attraversare le membrane: il SNC è particolarmente esposto, in quanto molto vascolarizzato e non protetto sebbene vi sia la barriera ematoencefalica. Metabolismo: a digiuno il picco alcolemico è raggiunto molto velocemente (dopo min), e l alcolemia decresce di 1 gr/kg/ora, scomparendo di solito nel giro di 4-6 ore. Una volta nel sangue, l alcool tende ad accumularsi nei tessuti più perfusi: circa il 90% raggiunge il fegato tramite il circolo portale, dove viene ossidato ad acqua ed anidride carbonica. Il 5-20% è eliminato con l aria espirata, le urine ed il sudore. Una quota giunge immodificata ai tessuti, specialmente quelli ad elevato contenuto lipidico (SNC). L'ossidazione epatica avviene secondo tre possibili vie: Etanolo acetaldeide acetato + CO2 + H 2 O Alcol deidrogenasi Aldeide deidrogenasi NAD NADH NAD NADH Citosol Etanolo acetaldeide MEOS NADP + O 2 NADPH + H 2 O MEOS [Cyt P450] Etanolo + H 2 O 2 2H 2 O + acetaldeide Catalasi Catalasi dei perossisomi Il MEOS (Sistema microsomiale di ossidazione dell etanolo) è un sistema multienzimatico inducibile nel reticolo endoplasmatico liscio: negli alcolisti l'assunzione di farmaci in contemporanea all'alcol rende più lunga l'emivita del farmaco; l'assunzione lontano dall'alcol invece li fa metabolizzare velocemente. 3. Effetti tossici: metabolici, nutrizionali L effetto tossico dell etanolo è dato dalla presenza di acetaldeide (dà cefalea e vampate di calore), dall induzione di radicali liberi dell ossigeno e dalla riduzione del rapporto NAD/NADH (che provoca diminuzione della glicolisi, diminuzione della beta-ossidazione, diminuzione del catabolismo proteico, con accumulo dei vari composti macromolecolari). Alterazioni del metabolismo lipidico: interferenza con il ciclo di Krebs ed i processi di fosforilazione ossidativa mitocondriale, che si traduce in un rallentamento dell ossidazione degli acidi grassi e loro accumulo (steatosi) Accumulo di lipidi in fegato, miocardio e tubuli renali sia per accumulo che per mancato utilizzo; l'ingestione di lipidi ed alcol ne aumenta l' uptake; l'aumento del rapporto NADH/NAD + fa aumentare l'α-glicerol-fosfato aumentando quindi la sintesi di trigliceridi Iperlipemia (tipo IV) da colesterolo, trigliceridi e lipoproteine VLDL Alterazioni del metabolismo proteico Accumulo epatico di proteine per diminuzione della capacità di rilascio (in particolare l'albumina) 7

8 Alterazioni del metabolismo glucidico Diminuzione della gluconeogenesi per carenza di disponibilità di glicerolo (utilizzato per la sintesi di trigliceridi), piruvato (l'aumento del rapporto NADH/NAD + fa aumentare la sua riduzione in lattato), diminuzione dell'utilizzazione degli aminoacidi (diminuzione del trasporto, e dell'attività dell'enzima glutamico-deidrogenasi) Diminuzione del glicogeno epatico per diminuzione del glucosio con la dieta e patologia epatica concomitante Alterazioni nutrizionali Ridotto apporto calorico-proteico: ridotto apporto dietetico (per l effetto sostitutivo dell etanolo, ad elevato contenuto calorico: 7 Kcal/g). Alterazione dell assorbimento di folati e vitamine. Malassorbimento di substrati energetici per gastrite alcol-indotta, pancreatite, malassorbimento Ridotto apporto vitaminico: il fegato è il maggior deposito di vitamine e ne converte molte in forma attiva. Le vitamine sono perdute per necrosi degli epatociti, e diminuisce l'assorbimento di vitamine liposolubili (A, D, K, E) Alterazione di ioni minerali: aumenta il ferro epatico; diminuisce il ferro ematico (per diminuzione nell'apporto dietetico, perdite per emorragia gastrointestinale cronica); diminuisce lo zinco (per diminuzione nell'apporto dietetico, aumento dell'escrezione urinaria); aumenta il piombo (contenuto in bevande alcoliche); diminuisce il magnesio (per diminuzione nell'apporto dietetico, aumento dell'escrezione urinaria, chetosi da digiuno, vomito); diminuisce il calcio (per diminuzione dell'assorbimento, aumento dell'escrezione urinaria); diminuisce il fosforo (per diminuzione nell'apporto dietetico, diarrea e vomito, deficit di magnesio, antiacidi contenenti alluminio). Kwashiorkor: sindrome dovuta a carenza proteica, caratterizzata da ventre prominente dovuto ad ascite e steatosi: a causa della diminuita produzione di proteine plasmatiche, diminuisce la pressione oncotica del plasma con conseguente edema interstiziale. Marasma: sindrome da carenza calorica, caratterizzata da delezione adiposa nelle zone normalmente preservate quali guance e palmo delle mani. 4. Principali danni d organo L'alcolismo è una malattia multisistemica che coinvolge Fegato Steatosi, dovuta all accumulo di trigliceridi nella cellula epatica, secondario sia ad un eccessiva sintesi, sia ad un difetto di escrezione per ridotta produzione di lipoproteine. Fibrosi, per effetto tossico diretto da parte dell'acetaldeide e per compensazione dell'epatonecrosi Cirrosi: diffusa trasformazione nodulare dell organo (noduli di rigenerazione) Epatocarcinoma Pancreas L'alcol aumenta gli acidi gastrici e di conseguenza la secrezione pancreatica, che aumenta la propria secrezione proteica, causando precipitazione duttale di proteine, con conseguente sclerosi duttale, che porta ad insufficienza pancreatica e pancreatite acuta Sistema nervoso centrale e periferico 0.25 g/l = disinibizione 0.5 g/l = impaccio motorio, incoerenza logica 1 g/l = evidenti disturbi dell equilibrio e della marcia 2.5 g/l = confusione, torpore mentale, stupor 4 g/l = coma 8

9 Patologie tossico-carenziali: Neuropatia ottica retrobulbare: progressiva diminuzione della vista, alterazioni del senso cromatico (rosso e verde), scotoma bilaterale centrale Sindrome di Wernicke-Korsakoff: il deficit di tiamina (B 1 ) causa una triade con deficit cognitivi, oftalmoplegia ed atassia con esordio acuto (S. di Wernicke), che possono evolvere nella psicosi di Korsakoff caratterizzata da quadro amnesico-confabulatorio e disturbi comportamentali. Polineuropatia periferica: sensitiva o sensitivo-motoria Patologie associate: Miopatia cronica (ipotrofia e ipostenia dei muscoli prossimali), Malattia di Marchiafava-Bignami, Degenerazione cerebellare, Demenza alcolica (deterioramento mentale progressivo, irreversibile, di talami mediali, lamina quadrigemina, ponte), atrofia cerebrale Patologie secondarie alla cirrosi epatica: Encefalopatia epatica (il fegato non è più in grado di eliminare l NH 3 producendo urea; si ha dunque iperammoniemia, che provoca un aumento di glutammina nel SNC con proliferazione degli astrociti ed edema cerebrale.), Degenerazione cronica epato-cerebrale Sindrome da astinenza da alcol: Delirium tremens caratterizzato da disturbi di memoria e sonno, ansia, agitazione, stato confusionale con allucinazioni (microzoopsie), tremore a grandi scosse, atassia e crisi epilettiche. Si hanno anche febbre, disidratazione, ipotensione e bradicardia Sistema endocrino: aumenta la secrezione di cortisolo con alcolemia > 100mg/dL, mentre un consumo cronico causa, per inibizione dell'adenoipofisi, diminuzione di ACTH (e cortisolo) e GH (che comporta ipoglicemia), di ormone antidiuretico (che comporta poliuria e perdita di minerali con le urine), di prolattina; inoltre c'è un deficit di testosterone Sistema emopoietico: anemia megaloblastica, anemia sideropenica (per deficit di acido folico e soppressione dell'attività emopoietica), diminuzione dei globuli bianchi e delle piastrine; aumento delle IgA e diminuzione dei linfociti Cuore: disturbi del ritmo e cardiomiopatia dilatativa per accumulo di lipidi Carcinomi: al fegato, alle prime vie alimentari (cavità orale, faringe, laringe) e ad esofago, pancreas, stomaco (cardias), colon, per tossicità diretta L esposizione ad etanolo del feto (sindrome feto-alcolica) causa ritardo nella crescita intrauterina e postnatale, anomalie cranio-faciali e cardiache, ritardo mentale, disturbi neuro-comportamentali ed alterazioni dell attenzione e dell'apprendimento. 5. Diagnosi di laboratorio Alcolemia (negativa dopo 12 ore di sospensione di bevande alcoliche; decresce di 1 g/kg/h) Alcoluria (negativa dopo 15 ore di sospensione di bevande alcoliche) A causa della rapida metabolizzazione dell etanolo, questi due test trovano impiego solo nella medicina legale e d urgenza. Aumentano: Gamma-glutamil transferasi (γ-gt): è il test che si altera più precocemente. Enzima microsomiale presente negli epatociti e nelle cellule epiteliali biliari (rene, pancreas, intestino). La sua sintesi può essere indotta anche da farmaci (contraccettivi orali, anti-epilettici). Marcatore di astinenza dall alcol. V.n.: 3-65 U/L Transaminasi: indicatori di necrosi epatocellulare AST (aspartato aminotransferasi): emivita 47 ore; localizzazione citoplasmatica. V.n.: 0-45 U/L ALT (alanina aminotransferasi): emivita 17 ore; localizzazione citoplasmatica (20%) e 9

10 mitocondriale (80%). V.n.: 5-55 U/L Bilirubina: è indicativa della quantità di tessuto epatico funzionante. Il 75% deriva dal catabolismo dell eme, che origina dal catabolismo dell emoglobina nel sistema reticoloendotelialele. La bilirubina non coniugata, non idrosolubile, si lega all albumina e trasportata al fegato, dove, ad opera dell enzima UDP-glucuroniltransferasi, viene coniugata con acido glucuronico ed escreta nella bile come bilirubina coniugata. V.n. bilirubina totale: < 1 mg/dl Immunoglobuline: per diminuita capacità delle cellule di Kuppfer (sistema reticolo-endoteliale dei sinusoidi epatici) di rimuovere dal circolo antigeni di provenienza gastrointestinale Lipidi: trigliceridi, colesterolo, acidi biliari Carboidrati: danno pancreatico, danno epatico, ipersecrezione di cortisolo causano iperglicemia Fosfatasi alcalina MCV delle emazie MEOS (può essere indotto anche da contraccettivi ormonali e farmaci antiepilettici) Diminuiscono Proteine plasmatiche: Valutazione: proteine totali, singole frazioni (albumina, α-, β-, γ-globuline). Tecniche di dosaggio: elettroforesi, isoelettrofocusing, metodi immunoenzimatici (ELISA) Albumina: PM 66kD, emivita: giorni; funzione di trasporto (bilirubina, acidi grassi, calcio, magnesio, ormoni, farmaci). Diminuisce per diminuzione della sintesi epatica e dell'intake con la dieta. V.n.: g/dl Fattori della coagulazione Carboidrati: la diminuzione della gluconeogenesi, dell'acth e del GH causano ipoglicemia a digiuno alcol-indotta; il potenziamento dell effetto dell insulina all ingestione di carboidrati causa ipoglicemia reattiva alcol-indotta 10

11 ESAME DEL LIQUIDO CEFALORACHIDIANO 1. Anatomia, produzione ed escrezione di liquor. 2. Funzione del liquor e significato della barriera ematoencefalica. 3. Prelievo del campione. 4. Pressione e dinamica liquorale. 5. Valutazione: macroscopica microscopica (conta e differenziazione cellule) chimica-immunologica microbiologica 1. Anatomia, produzione ed escrezione di liquor Il LCR è prodotto dai plessi corioidei dei ventricoli ed è riassorbito dai villi aracnoidei dei seni durali. Dai ventricoli laterali passa al III ventricolo attraverso i forami di Monroe; di qui, tramite l acquedotto di Silvio, passa al IV ventricolo da cui fuoriesce attraverso il forame mediano di Magendie e quelli laterali di Luschka, per circolare negli spazi subaracnoidei. Nell adulto ha volume di ml, e ne vengono prodotti 20 ml/ora: è totalmente ricambiato 3 volte/gg. 2. Funzione del liquor e significato della barriera ematoencefalica Funge da supporto meccanico del SNC; si occupa di rimuovere i prodotti del catabolismo cerebrale e trasportare sostanze metabolicamente attive, quali i releasing factors ipotalamici; determina il mantenimento dell'ambiente chimico circostante il SNC e dell omeostasi tra sangue e tessuto nervoso. 3. Prelievo del campione Il prelievo di liquor è utile nei casi di emorragia subaracnoidea (ESA), meningiti e meningoencefaliti, carcinomatosi meningea, encefalomieliti demielinizzanti (sclerosi multipla) [attualmente le tecniche di RM hanno notevolmente sostituito i prelievi di LCR], poliradiculoneuriti disimmuni (S. di Guillain- Barré), interessamento neurologico in corso di malattie infiammatorie/autoimmuni sistemiche, malattie degenerative (CJD, morbo di Alzheimer?), blocco del flusso liquorale. È controindicato nei casi di ipertensione endocranica, sepsi in vicinanza della regione lombare, compressione midollare. La rachicentesi si effettua in condizioni di assoluta sterilità, con pz. a digiuno in decubito laterale o seduto con il rachide iperflesso; si fora tra L4 ed L5 (e più distalmente nei neonati) con un ago G; prima di effettuare la puntura lombare si deve misurare la pressione liquorale (v.n.: mmh 2 O) e prelevare un campione di sangue venoso: in caso di ipertensione endocranica è controindicata la rachicentesi, che in caso di processi espansivi provocherebbe l erniazione delle tonsille cerebellari. In caso di pressione normale si prelevano per gocciolamento 5 ml di liquido, suddivisi in 3 provette. Il campione va conservato a temperatura ambiente per massimo un ora. Dopo la puntura, per evitare la cefalea post-rachicentesi il paziente deve rimanere in decubito prono per 4h e deve evitare di usare il cuscino per 24h. 4. Pressione e dinamica liquorale. Fattori che alterano la permeabilità della barriera ematoencefalica: Infiammazione: entrata nel SNC di macromolecole (albumina, penicillina ecc.) Neovascolarizzazione da tumori (tendono ad avere capillari fenestrati) Traumi ed ischemia che possono danneggiare i vasi Grado di maturazione: la concentrazione liquorale delle proteine è di 100 mg/dl nei primi 6 mesi di vita 11

12 5. Procedure per l esame del liquor a) Aspetto macroscopico b) Numero e tipo di cellule e presenza di microrganismi c) Contenuto di proteine e di glucosio d) Elettroforesi delle proteine ed immuno-elettroforesi: determinazione γ-globuline, bande oligoclonali, ecc. e) Esami biochimici: determinazione della presenza di lattato, NH 3, ph, CO 2, enzimi ecc. f) Colture batteriologiche, fungine ecc., ed isolamento di virus LCR Siero Osmolarità Sodio Potassio Calcio Magnesio Cloruri Bicarbonato 295 mosm/l 138 meq/l 2,3 meq/l 2,4 meq/l 2,7 meq/l 124 meq/l 23 meq/l 295 mosm/l 138 meq/l 4,1 meq/l 5,2 meq/l 1,9 meq/l 101 meq/l 23 meq/l pco 2 45 mmhg 38 mmhg ph 7,31 7,41 Azoto non proteico Ammonio Acido urico Urea 19 mg/dl 30 µg/dl 0,24 mg/dl 4,7 mmol/l 27 mg/dl 70 µg/dl 4 mg/dl 5,4 mmol/l Creatinina 1,1 mg/dl 1,6 mg/dl Fosforo 1,6 mg/dl 4,0 mg/dl Lipidi Colesterolo tot. Colesterolo esteri 1,25 mg/dl 0,4 mg/dl 0,8 mg/dl 876 mg/dl 180 mg/dl 125 mg/dl Glucosio > 45 mg/dl 90 mg/dl Proteine totali Albumina IgG mg/dl 155 mg/l 12,3 mg/l 6,5 8,4 g/dl 236 mg/l 802 mg/l a) Aspetto macroscopico: l LCR è incolore, limpido, come acqua di roccia ; può apparire torbido in caso di leucociti > 200/µl, o rosa-giallastro in caso di eritrociti > 500/µl (xantocromia). I sanguinamenti sub-aracnoidei possono essere dati da emorragia intracerebrale, rottura di aneurisma, ematoma epidurale, ematoma subdurale acuto o cronico; causano aumento della pressione liquorale, emazie fino ad 10 6 /µl, xantrocromia, leucocitosi (fino a 3.000/µl nell ESA) ed aumento delle proteine. Xantocromia: nella maggior parte dei casi è dovuta ad emorragia subaracnoidea (nel 10% dei casi la TC per questa patologia è negativa), causata da traumi, rottura di aneurismi (nei pazienti anziani), malformazioni artero-venose (nei pazienti giovani). Dopo 2-4 ore dall'evento la comparsa di ossiemoglobina (che diviene massima dopo 36h) conferisce un colore rosa-arancio; dopo 12 ore la bilirubina, che aumenta con il diminuire dell'ossiemoglobina (massima dopo 2-3 gg), conferisce colore giallastro. Altre cause possono essere ittero grave con aumento della bilirubina diretta/indiretta > mg/l; proteine oltre 150mg/100ml; melanosarcoma delle meningi. b) Microscopia, conta cellulare: può essere effettuata la conta a fresco nella camera di Fuchs- Rosenthal, che permette di distinguere le cellule nucleate dagli eritrociti, ma non i diversi leucociti; si può in alternativa effettuare lo studio citomorfologico del sedimento con colorazione 12

13 May-Grunwald-Giemsa, PAS o ematossilina/eosina. Nel liquor normale gli eritrociti sono < 10/µl negli adulti (< 650/µl nei neonati); i leucociti sono < 5/µl negli adulti (< 30/µl sotto 1 anno di età, < 20/µl tra 1 e 4 anni, < 10/µl tra i 5 ed i 16 anni). Sono invece assenti batteri, miceti, frammenti di echinococco e cisticerco. Aumento linfociti: meningiti (virale, tubercolare, micotica o parassitaria), sclerosi multipla, S. di Guillan-Barrè, sarcoidosi delle meningi, encefalopatia da abuso di sostanze Aumento neutrofili: meningiti (batterica, fase iniziale della virale o tubercolare, micotica, da amebe), ascessi cerebrali, empiema, emorragia subaracnoidea o cerebrale, iniezione di materiale estraneo (es. mezzi di contrasto o metotrexate), tumori metastatici. Aumento eosinofili: infestazioni parassitarie (Taenia solium, Schistosoma spp., Hypoderma bovis - larva migrans, Fasciola epatica), micotiche (Coccidioides immitis), iniezione di materiale estraneo nello spazio sub-aracnoideo (mezzo di contrasto, metotrexate) o derivazioni intracraniche. Aumento plasmacellule: meningite tubercolare, infestazioni parassitarie, sclerosi multipla, sindrome di Guillain-Barrè, sarcoidosi delle meningi Aumento macrofagi: meningite tubercolare o micotica, sostanze esogene (mezzi di contrasto, drenaggi ventricolari), emorragia subaracnoidea, infarto cerebrale. Possono anche essere presenti cellule leucemiche (leucemia linfoblastica acuta, leucemia mieloblastica acuta, leucemia promielocitica) o tumorali (tumori primitivi del SNC: medulloblastoma, astrocitoma, meningioma; tumori metastatici: melanoma, carcinoma del polmone, della mammella), e anche elementi dei microbi infestanti (elementi micotici, frammenti di cisti di Echinococco e Cisticerco). In caso di sospetta infezione del SNC si procede con l analisi del liquor sia con metodiche dirette (esame microscopico, colturale o ricerca di antigeni) che indirette (per meningiti virali, ove è utile la ricerca anticorpale intratecale). Meningite batterica: leucociti: /µl, di cui l'85-95% polimorfonucleati (che però possono essere assenti nelle prime fasi) aumento della pressione liquorale aumento delle proteine nel 90% dei casi, fino a mg/dl diminuzione del glucosio ( < 40% della glicemia) e dei cloruri aumento dell LDH (ha valore prognostico) e dell acido lattico (diagnosi differenziale con le meningiti virali) Meningite virale: cellule mononucleate: qualche centinaio, in prima giornata il 50% sono PMN aumento lieve delle proteine glucosio normale (diagnosi differenziale con tubercolosi, meningite micotica, carcinomatosi, linfoma, sarcoidosi) c) Componenti del liquor e siero Proteine: le proteine liquorali per l 80% sono di origine plasmatica e per il 20% di origine nervosa (proteine neuronali, astrocitarie o della mielina). V.n.: mg/dl Generalmente, un aumento delle proteine è sintomo di aumentata permeabilità, ridotta rimozione da parte delle granulazioni aracnoidee (meningiti, endocrinopatie, condizioni tossiche ecc.), ostruzione del circolo liquorale (compressione midollare da tumore, disco erniato, ascesso ecc.), aumentata produzione delle IgG (infiltrati linfocitarî e plasmacellulari nel SNC) o sanguinamento; una diminuzione è data da lesioni traumatiche della dura madre, delezione del liquor, aumento della pressione intracranica, ipertiroidismo. 13

14 Il miglior indicatore della funzionalità della barriera è il quoziente albuminico, perché l albumina è esclusivamente epatica e nel liquor è presente solo per passaggio: Si può valutare anche l indice IgG: Indice IgG: Quoziente albuminico = alb LCR alb Siero 1000, v.n.: < 6,5 IgG LCR IgG siero alb LCR alb siero = IgG LCR IgG siero alb siero alb LCR, v.n.: 0,25-0,85 L'indice IgG aumenta nelle patologie che causino una aumentata produzione di IgG nel SNC, con barriera ematoencefalica intatta (infezioni del SNC, meningiti virali, sclerosi multipla, sindrome di Guillan-Barrè); diminuisce nelle patologie che causano una alterazione della barriera: in caso di stroke, alcuni tumori e alcuni tipi di meningite (batterica). Glucosio: il glucosio liquorale è circa il 60% del glucosio plasmatico. V.n.: > 45 mg/dl Diminuisce per meningite acuta e cronica (batterica, tubercolare, fungina, amebica o da parassiti); nelle meningo-encefaliti virali si ha un modesto calo solo nel 25% dei casi; altre cause possono essere ipoglicemia sistemica, emorragia subaracnoidea, neurosifilide, neoplasie interessanti le meningi. Segue le variazioni del glucosio plasmatico in circa due ore. Sclerosi multipla: patologia immuno-mediata della sostanza bianca, con aree focali di demielinizzazione e disfunzione neuronale; a seconda della progressione è suddvisa in attacchi isolati, recidivante/remittente, secondariamente progressiva e primariamente progressiva. È caratterizzata da neurite ottica, deficit midollari (piramidali, sensitivi e sfinterici), oftalmoplegia intranucleare, nevralgia trigeminale, nistagmo e vertigini, disartria e tremore intenzionale. C è alterazione dei potenziali evocati, con lesioni caratteristiche in RMN. Pattern liquorale: modesta pleiocitosi mononucleare ( < 50 cellule/µl), modesto aumento delle proteine ( < 100 mg/dl) con grosso aumento delle IgG (fino al 12 13% del totale): aumenta quindi l'indice IgG, con bande oligoclonali. Aumenta anche la Proteina Basica della Mielina, che fungeva da indice prognostico in un test radioimmunologico non più utilizzato. Sindrome di Guillain-Barrè: caratterizzata da poliradiculoneuropatia infiammatoria demielinizzante, con esordio acuto con deficit motorio distale e simmetrico e rapida evoluzione (giorni o settimane). Pattern liquorale: c è dissociazione albumino-citologica, ovvero nessuna cellula nel liquor (è ammesso anche un aumento modesto fino a linfociti/µl) ma aumento enorme delle proteine, anche > 1000mg/dL, che danno un aspetto xantocromico, nonostante la barriera ematoencefalica sia intatta. La pressione liquorale è nella norma. d) Elettroforesi delle proteine ed immuno-elettroforesi: Indicatori di danno al SNC: Proteine di danno neuronale: NSE (neuron specific enolase); proteina (proteina neuronale coinvolta nella trasduzione del segnale e nell apoptosi, dosata nel liquor con metodi di immunoblotting); proteina Tau (associata ai microtubuli: promuove la polimerizzazione della tubulina e stabilizza i microtubuli), proteina Tau iperfosforilata (diminuisce la sua affinità per il citoscheletro, che diviene meno stabile) Proteine di danno da amiloide: Aβ(42) (frammento β-amiloide, 42 aminoacidi; proteina transmembrana neuronale e gliale). Proteine di danno astrocitario: GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein); S-100 (danno 14

15 anossico) Proteine di danno oligodendrocitico: MBP (Mielin Basic Protein) γ-globuline bande oligoclonali: l elettroforesi in gel agaroso (su liquor concentrato) permette di identificare nell ambito della frazione γ-proteine, proteine con la stessa mobilità elettroforetica. Compaiono nella sclerosi multipla (79-90% dei casi) ed in altre malattie infiammatorie del SNC. Malattie prioniche 5% acquisite: Kuru, Nuova Variante del morbo di Creutzfeld-Jacob (vcjd), CJD iatrogeno 85% sporadiche: morbo di Creutzfeld-Jacob (scjd), insonnia fatale (sfi) 10% familiari: morbo di Creutzfeld-Jacob familiare (fcjd), insonnia familiare fatale (FFI), morbo di Gerstmann-Sträussler-Sheinker (GSS) Sono rare malattie neurodegenerative fatali causate dalla modificazione patologica della proteina prionica PrPc (42% α-elica, solubile, proteasi-sensibile) di membrana nella sua forma infettiva non-ripiegata PrPsc (43% β-foglietto, fibrillare, insolubile, proteasi-resistente) intracellulare. Criterî diagnostici: CJD certa: verifica neuropatologica o ritrovamento di PrPsc con immunochimica o western blot CJD probabile: demenza a rapida progressione (in meno di 2 anni), con almeno due tra: mioclono, sintomi visivi o cerebellari, sintomi piramidali od extrapiramidali, mutismo acinetico. Pattern liquorale: presenza della proteina (recettore di membrana fortemente correlato al CJD se presente nel liquor), proteina Tau a livelli molto elevati, diminuzione della A-β(42). Elettroencefalografia: complessi ad onde lente CJD possibile: stesse caratteristiche cliniche, ma senza la proteina o i complessi ad onde lente. Alzheimer È la 4 a causa di morbilità dell anziano; se ne osservano una forma sporadica e una forma familiare dominante (20% delle forme precoci, 5% di tutte le forme). È caratterizzato da disturbo di memoria seguito dalla comparsa di disturbo del linguaggio e di altri deficit cognitivi. Si riscontra atrofia neuronale in specifiche aree cerebrali: corteccia parietale, lobo temporale, parte posteriore del giro del cingolo. Le lesioni neuropatologiche tipiche sono depositi extracellulari di fibrille insolubili di proteina amiloide Aβ(42) ed ammassi di filamenti intraneuronali di proteina Tau iperfosforilata. Il Precursore della Proteina amiloide (PPA) dà normalmente origine per il 90% alla proteina Aβ(40) che viene eliminata, e per il 10% alla Aβ(42) che diffonde nell'lcr e nel siero o è depositato sottoforma di placche; nei malati di Alzheimer il solo meno del 50% del PPA dà origine alla Aβ(40), mentre dal 50 al 100% forma la Aβ(42). La diagnosi è clinica, alternativamente si può utilizzare la biopsia; manca un marcatore biochimico prognostico e diagnostico: i marcatori liquorali sono in corso di validazione. La diagnosi definitiva è quindi solo post-mortem. Pattern liquorale: la proteina β-amiloide diminuisce sostanzialmente nell Alzheimer, meno nel CJD. La proteina Tau, sia totale che della forma iperfosforilata, aumenta. I marcatori liquorali in corso di validazione sono la diminuzione dei livelli della proteina Aβ(42) e l'aumento dei livelli di proteina Tau: proteina Tau-iperfosforilata è proposta come marcatore con maggiore accuratezza diagnostica (specificità) rispetto alla proteina Tau totale. e) Esami biochimici: lattato: la concentrazione di lattato nel liquor è quasi del tutto indipendente da quella ematica e proviene dal metabolismo anaerobico cerebrale; è un importante indice prognostico 15

16 nei traumi cerebrali. Aumenta in caso di traumi ed edema cerebrali, emorragie intracraniche, infarti cerebrali, idrocefalo, ascessi cerebrali, ipotensione, ipossia arteriosa, crisi epilettiche, meningiti batteriche, tubercolari e fungine. NH 4 e glutammina: l ammonio liquorale è ⅓ di quello plasmatico. Un aumento di ammonio liquorale è indice in genere di encefalopatia epatica. L'aumento di glutammina è proporzionale e secondario a quello di ammonio: essa aumenta quindi in caso di encefalopatia epatica, encefalopatie settiche ed encefalopatie da insufficienza respiratoria. Ammonio + ( α-chetoglutarato glutamato ) glutammina ph CO 2 enzimi 16

17 INDAGINI DI LABORATORIO CONVENZIONALI NELLE PATOLOGIE MUSCOLARI PRIMITIVE, NELLE SINDROMI MUSCOLARI DOLOROSE E NELLE MIOPATIE TOSSICHE E IATROGENE. I disordini del muscolo scheletrico possono essere patologie primitive delle fibre muscolari striate (miopatie) patologie della giunzione neuromuscolare (miastenia gravis, S. di Eaton-Lambert, blocco neuromuscolare delle giunzioni farmaco-indotto) atrofie muscolari neurogene (sclerosi laterale amiotrofica, atrofie muscolari) MIOPATIE Possono avere diverse cause, essendo congenite, infiammatorie, tossiche, disendocrine o metaboliche. L'anamnesi indaga la familiarità e l'età di esordio; il quadro clinico presenta un disturbo muscolare caratterizzato da un deficit di forza (transitorio e reversibile oppure progressivo), atrofia muscolare, intolleranza all esercizio, crampi, mialgie e mioglobinuria. All'esame obiettivo si indagano i deficit di forza, la ipo-/ pseudoipo-/atrofia muscolare, la dolorabilità o alterata consistenza alla palpazione delle masse muscolari. Il laboratorio agisce in tre vie: 1. Valutazione enzimatica: creatin-fosfochinasi (CPK), lattico deidrogenasi (LDH), aldolasi (ALD), transaminasi (AST e ALT). CPK: fosfocreatina + ADP = creatina + ATP [metabolismo muscolare, produzione di energia] Ne esistono tre forme isoenzimatiche: MM (>94-96%, muscolare), MB (<4-6%, cardiaco) e BB (tracce, cerebrale). Aumenta nelle distrofie congenite, nella polimiosite/dermatomiosite, nelle miopatie di varia natura, nell ipertermia maligna, alcolismo, S. di Reye, ma anche con cause non patologiche come esercizio muscolare, iniezioni i.m., traumi, crisi epilettiche, interventi chirurgici, sotto effetto di farmaci (morfina, anticoagulanti, salicilati ad alte dosi, amfotericina B, anestetici). v.n.: mu/µl - prelievo dopo 7gg di riposo, a digiuno da ore LDH: piruvato lattato (con NAD + ) [enzima della glicolisi] Aumenta nelle miopatie (infiammatorie e distrofie), nei traumi muscolari, nell infarto del miocardio, nelle anemie emolitiche e perniciosa, nella leucemia, nelle malattie epatiche, sotto steroidi anabolizzanti, anestetici, aspirina, alcool, narcotici, clofibrati: il prelievo deve essere preceduto da 24 ore di astinenza dei farmaci interferenti. v.n.: U/µl prelievo a digiuno da ore ALD: fruttosio-1,6-2p diidrossiacetone-p + gliceraldeide-3p [quarto step della glicolisi] È presente in tre forme isoenzimatiche formate da due subunità: l'isoforma A predomina nel muscolo scheletrico, B nel fegato e C in cervello ed altri tessuti. I livelli sierici aumentano nella distrofia muscolare di Duchenne, in polimiosite/dermatomiosite, patologie epatiche croniche, infarto del miocardio, pancreatite emorragica, con l'assunzione di farmaci epatotossici, antielminti ed insetticidi. v.n.: 0-8 mu/µl TRANSAMINASI: Aspartato amino-transferasi (AST o GOT), Alanina amino-transferasi (ALT o GPT) L'elevazione degli enzimi è considerata espressione di malattia epatica, dato che il fegato ne è particolarmente ricco: di conseguenza, in corso di miopatia, con un innalzamento delle transaminasi, in particolare della AST, la diagnosi può essere erroneamente indirizzata verso una malattia del fegato, se contemporaneamente non si procede ad una valutazione della CPK. 17

18 2. Elettromiografia: consiste nella registrazione dell attività elettrica muscolare; si utilizzano elettrodi di derivazione superficiali (dischetti di argento o rame, posti sulla cute soprastante il ventre muscolare) o di profondità (aghi inseribili nel ventre muscolare). Tramite questo esame si vanno a differenziare le affezioni che possono essere neurogene (disturbi dei nervi) o miogene (disturbi dei muscoli). L'elettromiografia viene eseguita dal medico e tecnico: la prima parte viene eseguita dal tecnico di neurofisiopatologia e consiste nello stimolare (attraverso stimoli di natura elettrica) i nervi periferici e registrare le relative risposte sui muscoli innervati dal quel nervo; la seconda parte viene eseguita dal medico e consiste nell'inserzione di un ago elettrodo coassiale nei muscoli che si vogliono indagare. 3. Biopsia muscolare: perché sia efficace, il muscolo non deve essere cospicuamente interessato dal processo morboso, né essere stato sottoposto da poco tempo a procedure diagnostico-terapeutiche traumatizzanti quali terapia iniettiva o EMG. Si può effettuare a cielo aperto, ovvero aprendo chirurgicamente i piani soprastanti il muscolo di interesse, oppure ad ago. Si effettuano poi un'indagine istologica attraverso colorazioni, o uno studio istochimico dell'atpasi acida o basica, enzimo- o immunoistochimico ed ultrastrutturale. 1. Miopatie congenite Le miopatie congenite rappresentano il più ampio ed eterogeneo gruppo di miopatie geneticamente determinate. Alterazione istopatologica: degenerazione primitiva delle miofibre con conseguente necrosi e progressiva riduzione numerica, che porta a fibrosi e/o sostituzione con tessuto adiposo. Al microscopio ottico si notano una notevole variazione delle dimensione delle fibre, migrazione centrale dei nuclei sarcolemmali; aree di atrofia e necrosi, con segni di rigenerazione abortiva; iperplasia del tessuto connettivo interstiziale ed infiltrazione di cellule adipose. Radiologicamente il tessuto muscolare si mostra sostituito da tessuto bianco (fibroadiposo). Distrofia muscolare di Duchenne Esordisce entro il terzo anno di vita con iniziale interessamento del cingolo pelvico, seguito da quello scapolare; intorno ai anni si ha perdita della deambulazione autonoma, cui si associano interessamento cardiaco (cardiomiopatia dilatativa) e ritardo mentale (QI medio < 10%). La morte avviene entro la seconda decade per complicazioni polmonari (insufficienza respiratoria) e/o cardiache. È una miopatia ereditaria degenerativa trasmessa con ereditarietà X-linked. Il gene mutato è Xp21, produttore della distrofina, proteina con funzione di supporto strutturale del sarcolemma. L'analisi immunoistochimica avviene attraverso la colorazione della distrofina sul contorno delle fibre muscolari tramite anticorpi che vi si legano. Distrofia di Becker: ridotta colorazione delle fibre Distrofia di Duchenne: assenza di distrofina Diagnosi di laboratorio: aumento imponente di CPK > U/Lt, con aumento marcato all esordio, picco in 1-2 anni, e progressiva riduzione per riduzione della massa muscolare; aumento di mioglobina, ALD, LDH e transaminasi. Oltre alla EMG e alla biopsia, è fondamentale la diagnosi molecolare per identificare le mutazioni a carico del gene della distrofina, che fornisce conferma diagnostica; tale analisi può essere prenatale (dalla 10 a sett, su villi coriali o amniociti) o fornire la diagnosi di portatrice in donna con parenti affetti. Si effettua mediante Southern blot o multiplex PCR. 2. Miopatie infiammatorie Le miopatie infiammatorie rappresentano il più ampio gruppo di miopatie acquisite dell età adulta. Sono malattie molto rare: la polimiosite ha incidenza di 1/ e colpisce gli adulti; la dermatomiosite ha incidenza di 1/ , con due picchi di incidenza: tra i e i anni; le donne sono colpite 18

19 due volte più degli uomini; l'associazione con neoplasie è maggiore negli anziani (ca. mammella, polmoni, addome e pelvi). La IBM ha incidenza di 1/ , colpisce i maschi anziani ed è rara sotto i 50 anni. Dermatomiosite (DM) Si presenta con un rash eliotropico (palpebre, guance e collo), in quanto coinvolge il sistema vascolare (soprattutto il microcircolo), che precede l'interessamento muscolare sempre simmetrico e con distribuzione analoga alla PM. Papule di Gottron sulle dita e gomiti. Calcinosi del tessuto sottocutaneo e fascia intermuscolare, specie nella miosite infantile. Disfagia. Sintomi extra-muscolari: sistemici (febbre, malessere, calo ponderale), artralgie, vasculite. Alla biopsia si osservano microinfarti per alterazioni vascolari, atrofia perifascicolare, fibre normali inframmezzate da fibre necrotiche e rigenerate; l infiltrato infiammatorio perimisiale è scarso (CD4+ e B) o assente. Aumento frequente della CPK, aumento (più lieve) della mioglobina. Per la frequente associazione con una neoplasia, che può evidenziarsi dopo anni dalla miosite, è raccomandato uno screening dei marcatori neoplastici ogni 6 mesi. Polimiosite (PM) Ha esordio subacuto, insidioso per alcuni mesi. Presenta ipostenia prossimale spesso senza mialgie, simmetrica. Coinvolgimento cardiaco. Aumento frequente della CPK, e aumento (più lieve) della mioglobina. Alla biopsia si osservano infiltrati infiammatori endomisiali con cellule predominanti T CD8 e macrofagi. Invasione e necrosi di miofibre. Miosite a corpi inclusi (IBM) Spesso è sospettata quando un pz. con presunta polimiosite non risponde alla terapia. Caratteristiche cliniche distintive sono: interessamento spesso asimmetrico, di quadriceps femoris, e muscoli distali (estensori del piede, flessore profondo delle dita, piccoli muscoli delle mani); debolezza facciale e disfagia. Alla biopsia si osservano infiltrati infiammatori endomisiali con cellule predominanti T CD8 e macrofagi. Invasione e necrosi di miofibre. Diagnosi di laboratorio: CK non è sempre elevata, ma può raggiungere livelli 50 volte il limite superiore della norma, sia nella PM che DM. Nella IBM la CK è normale o solo lievemente elevata. AST, ALT, LDH ed aldolasi possono essere aumentate in associazione con CK. Aumento degli indici di flogosi. EMG: unità motorie di tipo miopatico + fibrillazioni. Scariche complesse ripetitive nelle forme croniche. Biopsia muscolare: lesioni spesso sparse; occasionalmente normale. 3. Miopatie tossiche Sono diversi i farmaci o le sostanze tossiche in grado di causare una miopatia necrotizzante acuta e subacuta: i sintomi sono dolore e dolorabilità muscolare, deficit di forza, a volte mioglobinuria con possibile insufficienza renale. I farmaci potenzialmente miotossici sono D-penicillamina, zivudina (AZT), emetina, clorochina, steroidi, cimetidina, lovastatina ecc. Aumenta la CPK; all EMG si osserva un quadro miopatico; la biopsia mostra necrosi diffusa associata ad attività rigenerativa, un infiltrato infiammatorio endomisiale (D-penicillamina, AZT). Se l agente causale è prontamente rimosso, sono in genere reversibili. Statine: farmaci usati nel trattamento delle ipercolesterolemie; bloccano competitivamente la sintesi del colesterolo epatico inibendo l azione dell enzima idrossi-metilglutaril CoA reduttasi. Sono farmaci molto maneggevoli, da non somministrare a donne gravide. Gli effetti collaterali sono scarsi e simili fra le diverse molecole: aumento delle transaminasi, senza una reale epatopatia aumento dei livelli di CP e CPK, talvolta (raramente) accompagnati da mialgie e segni di miopatia 19

20 4. Miopatie metaboliche Sono causate da disordini del metabolismo energetico muscolare, a livello di: a) catena respiratoria mitocondriale b) metabolismo dei carboidrati c) metabolismo lipidico Deficit di forza agli arti transitorio e reversibile: intolleranza all esercizio: dopo pochi minuti nelle glicogenosi, dopo diverse ore nelle lipidosi crampi: nelle glicogenosi anche dopo alcuni min; se l esercizio viene ripreso, contrattura dolorosa e mioglobinuria. mialgie: nelle lipidosi, dopo esercizio prolungato (ma non contratture dolorose); scatenate anche da digiuno, freddo, infezioni, anestesia. mioglobinuria: aumento di CK, urine scure, rischio di insufficienza renale Debolezza muscolare progressiva: muscoli estrinseci dell occhio; muscoli dei cingoli a) Malattie mitocondriali: i mitocondri vengono ereditati esclusivamente dalla madre, essendone lo spermatozoo privo; per le peculiari modalità replicative e di segregazione di tali organelli, è facilmente comprensibile come possano aversi disfunzioni mitocondriali a carico di specifici organi o tessuti, mentre altri possono essere risparmiati. Le membrane mitocondriali includono proteine sintetizzate a partire dal DNA mitocondriale (13 subunità dei complessi della catena respiratoria) o della cellula ospite: le malattie mitocondriali comprendono sia patologie originanti da mutazioni del DNA della cellula ospite (deficit dei complessi della catena respiratoria [il Complesso II è codificato interamente da DNA nucleare], difetti di importazione delle proteine mitocondriali, mutazioni in geni coinvolti nella sintesi proteica), sia da mutazioni del DNA mitocondriale (difetti di motilità / fusione / fissione: OPA1; danno ossidativo e per metabolismo mitocondriale del ferro: FRDA; deficit di sintesi delle subunità dei complessi della catena respiratoria) per mutazioni puntiformi, delezioni singole, duplicazioni, o, ancora, da difetti di comunicazione tra i due (MNGIE) per delezioni multiple, deplezione di DNA mitocondriale. La trasmissione sarà nel primo caso mendeliana, autosomica, mentre nel secondo caso sarà matrilineare (tutta la progenie della madre affetta è malata); vi possono naturalmente anche 20

21 essere casi sporadici. In ogni cellula vi sono numerosi mitocondri, e ciascuno contiene numerose copie del mtdna (poliplasmia); nella stessa cellula vi possono pertanto essere mitocondri con genoma normale e mitocondri con genoma mutato (eteroplasmia): perché la mutazione abbia espressione fenotipica è necessario un certo tasso di mtdna mutante (effetto soglia). Ad ogni mitosi la proporzione di DNA normale e mutato può cambiare. La funzionalità mitocondriale si basa inoltre sulla disponibilità di O 2 e di piruvato. Una carenza di quest'ultimo può derivare, più frequentemente, dal deficit enzimatico di PFK (fosfofruttokinasi), enzima prossimale della glicolisi; fosfoglicerokinasi e fosfogliceromutasi sono invece enzimi distali. Il deficit della glicogenolisi (glicogeno fosforilasi) è superabile proseguendo nell'esercizio muscolare, con l'afflusso del glucosio ematico (fenomeno second wind ): il paziente sente dolore all'inizio dell'esercizio, ma continuandolo, la vasodilatazione fa aumentare l'apporto di glucosio con il sangue ed i sintomi scompaiono, producendo quantità normali di piruvato e lattato. Le malattie mitocondriali sono rare ma molto più frequenti delle miopatie, con una prevalenza nei pz. clinicamente affetti di 9,2 / , e nei pz. non-affetti (portatori sani) di 16,5 / Le manifestazioni sono più frequenti in quei tessuti che richiedono energia: SNC, muscolatura estrinseca dell'occhio, sistema endocrino, cuore. Chronic progressive external ophthalmoplegia (CPEO) Delezione singola (50%) Oftalmoplegia esterna, ptosi bilaterale (leggera miopatia prossimale) Kearns Sayre syndrome (KSS) Delezione singola (>95%) Oftalmoplegia esterna progressiva con retinopatia pigmentaria, associata a proteine liquorali > 1 g/l, o ad atassia cerebellare, o ad arresto cardiaco. Sordità bilaterale, miopatia, disfagia, diabete, ipoparatiroidismo, demenza. Mitochondrial encephalopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes (MELAS) Mutazione puntiforme Mut. punt. A3243G Nella maggior parte dei casi i segni e sintomi appaiono nella gene trna Leu fanciullezza, a seguito di un periodo di accrescimento normale. I sintomi precoci possono includere debolezza e dolore muscolare, cefalee ricorrenti, perdita dell appetito, vomito e convulsioni. Nella maggior parte dei casi prima dei 40 anni appaiono gli episodi simil-ictus che spesso coinvolgono più distretti vascolari, ci sono alterazioni della coscienza, della vista, convulsioni ed emicrania. Attacchi ripetuti possono progressivamente portare alla demenza e alla paralisi. Frequentemente gli affetti mostrano acidosi lattica, causa di molti dei sintomi sopra elencati; più di rado si possono avere diabete, cardiomiopatia, sordità, retinopatia pigmentaria e atassia cerebellare. Leber s hereditary optic neuropathy (LHON) Mutazione puntiforme Mutazioni diverse, che colpiscono diverse subunità del Complesso I ma danno la stessa manifestazione clinica. Mut. punt. G11778A, T14484C, G3460A geni complesso I La patologia esordisce con la perdita improvvisa della vista da un occhio, seguita dopo qualche settimana dall altro: la fase acuta perdura qualche settimana; all esame del nervo ottico si osserva edema e microangiopatia. La malattia colpisce esclusivamente il nervo ottico, ed è presente solo nei maschi. Sintomi correlati possono essere distonia, affaticamento cardiaco. 21

22 Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres (MERRF) Mutazione puntiforme I pazienti sono bassi, hanno miocloni (contrazioni/fibrillazioni involontarie) di singoli muscoli o fascetti, convulsioni, atassia cerebellare e miopatia. Gruppetti di mitocondri alterati si raggruppano nella regione sub-sarcolemmatica apparendo come fibre rosse a gruppetti sotto colorazione tricromatica di Gomori modificata. Neuropathy, ataxia, retinis pigmentosa (NARP) È caratterizzata da ritardo nello sviluppo, retina pigmentata, demenza, convulsioni, atassia, neuropatia sensoria con debolezza della muscolatura prossimale. Maternally inherited Leigh Syndrome Nel primo mese di vita si hanno ritardo nell accrescimento, ipotonia, convulsioni, segni piramidali, atassia, retina pigmentata. Diagnosi di laboratorio: 1. Screening di laboratorio di base Lattato e piruvato serico a riposo. Rapporto lattato/piruvato V.n. acido lattico a riposo: sangue venoso: 0,5 1,3 mmol/l (5 12 mg/dl) sangue arterioso: 0,36 0,75 mmol/l (3 7 mg/dl) Lattato, piruvato e proteine liquorali CK serica Elettroliti Conta completa delle cellule del sangue Glicemia, test di tolleranza al glucosio Funzionalità epatica Funzionalità renale Mut. punt. A8344G gene trna Lys Mut. punt. T8993G/C gene ATPasi 6 2. Valutazione di laboratorio funzionale Lattato venoso: aumenta eccessivamente in rapporto all intensità dell esercizio ed all uptake di ossigeno Quattro prelievi: a riposo, dopo 5 di es., dopo 15 di es., dopo 30 post-esercizio (v.n.: < 18 mg/dl) Massimo uptake di ossigeno ed output cardiaco: in presenza di un deficit della fosforilazione ossidativa l aumento dell output cardiaco è maggiore dell aumento del consumo di ossigeno (ΔQ/ΔO 2 > 5) l estrazione di O 2 per unità di sangue rimane sostanzialmente invariata durante l esercizio, mentre aumenta il lattato l'aumento della ventilazione relativamente all uptake di ossigeno è eccessivo: il consumo di O 2 diminuisce, ma il sistema cardiovascolare ne percepisce la minore estrazione dal sangue e fa aumentare la ventilazione 3. Valutazione funzionale in vivo: Spettroscopia RM del 31 P Riposo: [ATP], [fosfocreatina], [P i ], [ADP] ph citosolico Esercizio: produzione glicogenolitica e glicolitica di ATP Recupero post-esercizio: produzione mitocondriale di ATP; velocità di trasporto 22

23 extracellulare di H + 4. Biopsia muscolare istochimica: si osservano accumuli sub-sarcolemmali di mitocondri che appaiono come ragged red fibers alla colorazione tricromatica di Gomori; conferma alla colorazione istochimica per l enzima succinato deidrogenasi (SDH); vi sono miofibre citocromo-ossidasi negative (deficit di attività enzimatica), eccessivo accumulo di glicogeno, gocce lipidiche. Le alterazioni ultrastrutturali sono l'aumento di numero e dimensioni dei mitocondri, le creste mitocondriali rarefatte, rigonfie o con alterato orientamento, le inclusioni paracristalline (accumuli intermembranosi di CPK). L'attività degli enzimi della catena respiratoria è ridotta. b) Disordini del metabolismo dei carboidrati: sono patologie ereditarie causate da difetti negli enzimi coinvolti nella sintesi o nella degradazione del glicogeno, che si accumula in quantità eccessiva o in forme anomale; gli organi più colpiti sono il fegato (epatomegalia ed ipoglicemia), il muscolo (debolezza progressiva, intolleranza allo sforzo e crampi). Glicogenosi muscolari In molte forme di GM sono interessati enzimi espressi non solo a livello muscolare. Il glicogeno è la principale fonte di glucosio per la glicolisi; in condizioni aerobie il prodotto finale della glicolisi è il piruvato che entra nel ciclo di Krebs. Gli equivalenti riducenti generati nella glicolisi sono trasferiti via NADH alla catena respiratoria mitocondriale. In condizioni anaerobie il NADH generato è riossidato a NAD + dalla riduzione del piruvato a lattato da parte dall enzima LDH. Non tutti gli enzimi il cui deficit è responsabile di GM sono coinvolti nella produzione di energia (ad es. deficit di maltasi acida). Sono malattie rare e molto eterogenee, comprendenti forme molto gravi ad esordio infantile ed incompatibili con un normale sviluppo, e forme lievi con sintomatologia episodica nell età adulta. Sintomi A riposo: assenza di sintomi Durante l esercizio: intolleranza allo sforzo, dolore e crampi, contratture muscolari elettricamente silenti, rabdomiolisi, mioglobinuria Debolezza muscolare (spesso progressiva), atrofia muscolare Deficit enzimatico miofosforilasi fosforilasikinasi fosfofruttokinasi fosfogliceratokinasi fosfoglicerato mutasi lattatodeidrogenasi enzima deramificante enzima ramificante maltasi acida Esami di laboratorio funzionali Test muscolare ischemico: si effettua nei muscoli dell avambraccio; si inserisce una cannula in una vena antecubitale, e si effettuano diversi prelievi: stato basale, ed 1, 2, 5 e 15 min dopo un esercizio ischemico (manicotto sul braccio) di durata massima 2 di flessione dei muscoli delle dita. Si valutano il lattato (glicolisi) e l ammonio (adenilato de-aminasi); è un test doloroso che, seppur raramente, può scatenare un episodio di mioglobinuria. Durante l esercizio ischemico non avviene la fosforilazione ossidativa e viene utilizzato ADP per produrre energia: 2ADP ATP + AMP IMP + ammonio [adenilato kinasi] 23 [monoadenilato deaminasi]

24 Nei soggetti sani le variazioni di lattato ed ammonio sono consensuali; nei pz. con glicogenosi, non funzionando la glicogenolisi, non viene prodotto lattato, ma l ammonio aumenta molto, proporzionalmente all'intensità dell'esercizio svolto, indice dell'effettiva attività muscolare. Spettroscopia RM del fosforo intramuscolare: si effettua sui muscoli del polpaccio, sul quadricipite o sui flessori delle dita, nella maggior parte dei casi in condizioni aerobiche. Si valutano la concentrazione dei metaboliti fosforilati ed il ph a riposo, il ph e gli intermedi monofosfati della glicolisi (intermedi metabolici fosforilati PME) durante l esercizio, la velocità di risintesi di fosfocreatina postesercizio. Glicogenosi di tipo V (malattia di McArdle) Deficit di (glicogeno-)miofosforilasi (isoenzima muscolare che idrolizza i legami α,1-4 del glicogeno). È la forma di glicogenosi più frequente, si trasmette in modo autosomico recessivo, sono state identificate 21 mutazioni a carico del gene della miofosforilasi sul cr.11. Si presenta con intolleranza all esercizio, dolori e contratture muscolari; la sintomatologia muscolare può essere alleviata dalla comparsa del fenomeno second wind. Episodi di mioglobinuria nel 50% dei casi, CK sierica elevata in oltre il 90%. Al test ischemico c è ridotta produzione di lattato ed aumentata di ammonio; alla biopsia si osservano accumuli sub-sarcolemmali di glicogeno associati ad assenza di attività miofosforilasica. Alla spettroscopia del fosforo risultano una ridotta concentrazione dell'atp a riposo, assenza di acidificazione e mancato aumento dei PME durante l esercizio muscolare; lenta risintesi di PCr nel post-esercizio. Glicogenosi di tipo VII (malattia di Tauri) Deficit di fosfo-fruttocinasi. Si trasmette in modo autosomico recessivo. L enzima è un tetramero. La PFK è costituita da sole subunità M (cromosoma 1) nel muscolo, da sole subunità L (cromosoma 21) nel fegato e sia da subunità M ed L nei globuli rossi. Si presenta con intolleranza all esercizio, dolori e contratture muscolari; è assente il fenomeno second wind. Episodi frequenti di mioglobinuria, CK sierica elevata nella maggioranza dei casi, emolisi, aumentate reticolocitosi e bilirubinemia. C è iperuricemia per aumento di attività dell adenilato deaminasi. Al test ischemico c è ridotta produzione di lattato ed aumentata di ammonio; alla biopsia si osservano accumuli sub-sarcolemmali di glicogeno e deficit di PFK rilevato tramite istochimica, con un'attività dell'enzima pressoché assente. Alla spettroscopia del fosforo risultano una ridotta concentrazione dell'atp a riposo, assenza di acidificazione e marcato aumento dei PME durante l esercizio muscolare; lenta risintesi di PCr nel post-esercizio. Glicogenosi di tipo II (Malattia di Pompe) Deficit di maltasi acida, enzima lisosomiale, idrolizza i legami α,1-4 e α,1-6 del glicogeno. Si trasmette in modo autosomico recessivo, mutazioni sul cr. 17. Non c'è una alterazione nella produzione energetica: il deficit enzimatico causa accumulo di glicogeno nei lisosomi che scoppiano liberando il loro contenuto enzimatico nel citosol. Nell adulto c è debolezza dei cingoli lentamente progressiva, con precoce interessamento dei muscoli respiratorî (in particolare il diaframma); è rara una epatomegalia; in alcuni casi ci sono anomalie dei vasi intracranici, con rotture di aneurismi. Nell infante (malattia di Pompe) c è glicogenosi generalizzata (muscolo 24

25 scheletrico, cardiaco, fegato) con morte entro i 2 anni. Al test ischemico c è normale produzione di lattato e di ammonio; alla biopsia si osserva una miopatia vacuolare, con vacuoli di glicogeno positivi per la fosfatasi acida (indicante la loro origine lisosomiale); c è accumulo di glicogeno anche nei linfociti; la CK sierica è moderatamente elevata. 25

26 DIAGNOSTICA CON SPETTROSCOPIA RM Principî generali di Risonanza magnetica Lo spin è il momento angolare intrinseco associato alle particelle. Diversamente dagli oggetti rotanti della meccanica classica, che derivano il loro momento angolare dalla rotazione delle parti costituenti, lo spin non è associato con alcuna massa interna. Ad esempio, le particelle elementari, come gli elettroni, possiedono uno spin, anche se sono particelle puntiformi. Altre particelle subatomiche, come i neutroni, che hanno carica elettrica nulla, possiedono uno spin non nullo. Lo spin posseduto da ogni particella ha un valore s definito che dipende solo dal tipo di particella e che non può essere alterato in nessun modo. Gli elettroni hanno spin pari a ½. Le particelle con spin possono avere un momento di dipolo magnetico, esattamente come un corpo caricato elettricamente rotante in un campo magnetico disomogeneo; sono cioè sottoposte a una forza. Questo vale anche per gli elettroni: se un fascio di atomi di idrogeno nel loro stato fondamentale viene fatto passare attraverso un campo magnetico non uniforme, esso si divide in due fasci, ognuno dei quali contiene metà degli atomi. Le forze osservate variano per differenti elettroni, e queste differenze sono attribuite a differenze di spin. Quindi, tipicamente, lo spin degli elettroni viene misurato osservando la loro traiettoria in un campo magnetico disomogeneo. In accordo con le predizioni della teoria, solo multipli semi-interi di h/2π vengono osservati per gli elettroni. Tra le tecnologie emergenti della Medicina di laboratorio, la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo (MRS) è particolarmente innovativa perché consente di valutare direttamente sul paziente e in modo non invasivo la concentrazione intracellulare di alcuni intermedi metabolici ed esplorare la funzionalità di diverse vie metaboliche. Questa nuova metodica si basa sul fenomeno fisico della risonanza magnetica nucleare (NMR), descritto nel 1946 indipendentemente da F. Bloch e E.M. Purcell, ai quali, per questo, fu assegnato il premio Nobel per la Fisica nel Il fenomeno della risonanza magnetica nucleare si verifica nei nuclei degli atomi con spin diverso da zero. Questi posseggono un momento magnetico nucleare, specifico per ogni nucleo. Pertanto, quando sono immersi in un campo magnetico uniforme B 1 (nelle procedure di diagnostica di solito di 1,5-2 Tesla) si comportano come dipoli magnetici e tendono ad allinearsi in modo parallelo o antiparallelo all'asse del campo. Somministrando energia in forma di radiazioni elettromagnetiche di frequenza radio, i nuclei immersi nel campo magnetico statico passano ad uno stato energetico superiore, ruotando (angolo di flip: angolo di rotazione degli atomi). Quando s'interrompe la sorgente energetica i nuclei, riallineandosi all'asse del campo magnetico statico B 0, riemettono l'energia assorbita (precettano) sotto forma d'onda elettromagnetica di frequenza radio. Questi segnali, detti di risonanza magnetica, hanno lunghezza d'onda specifica per ogni nucleo e possono essere ricevuti da un'antenna idonea. Inoltre, quando il nucleo fa parte di una molecola emette un segnale di risonanza con lunghezza d'onda lievemente diversa a seconda della struttura della molecola di cui fa parte. In altre parole, la lunghezza d'onda del segnale di risonanza varia in funzione del microambiente chimico, quindi magnetico, nel quale è immerso il nucleo. Tale fenomeno, definito "chemical shift", consente di individuare molecole diverse contenenti lo stesso nucleo. Sensibilità: risposta data da un elemento in confronto con H, con sensibilità (Se) = 1; a parità di campo, fosforo, ossigeno etc. hanno Se inferiore. Frequenza di Larmor: si definisce frequenza di Larmor ω L la frequenza di precessione degli spin attorno ad un campo magnetico applicato. Il suo valore è dato dalla relazione ω L = γ B 0 (equazione di Larmor), dove B 0 è la densità del flusso magnetico applicato (espresso in Tesla); γ è una costante detta rapporto giromagnetico o costante di Larmor, caratteristica di ogni nucleo atomico (per il nucleo di idrogeno, il più usato in risonanza magnetica nucleare, il valore della costante γ è di 42,5756 Mhz/T). 26

27 La relazione tra campo magnetico e frequenza di oscillazione angolare (frequenza di Larmor) può essere usata in due modi: le indagini basate su questo principio della risonanza magnetica nucleare eseguibili sull'uomo non devono essere confuse poiché per la comprensione dei risultati sono richieste competenze culturali completamente diverse: 1. La MRI (Immagini di Risonanza Magnetica): se ad un organo/tessuto immerso in un campo magnetico viene applicata una perturbazione che genera un gradiente nel campo, la frequenza di oscillazione di ogni spin dipenderà dalla precisa posizione del nucleo nel campo magnetico. In questo modo il segnale NMR da informazioni sulla posizione del nucleo. Essa utilizza generalmente la risoluzione spaziale del forte segnale di risonanza del nucleo dell'idrogeno dell'acqua ( 1 H) per ricostruire immagini dettagliate delle strutture anatomiche; richiede una cultura squisitamente radiologica. 2. La MRS (Spettroscopia di Risonanza Magnetica): i vari nuclei non sono isolati, ma sono contenuti in diverse molecole. Gli elettroni attorno ai vari nuclei interferiscono con il campo magnetico esterno, per cui l effettivo campo magnetico attorno ad un nucleo non dipende solo dal campo esterno, ma anche dalla molecola di cui fa parte: l effettiva frequenza di risonanza di un stesso nucleo è leggermente diversa a seconda della molecola in cui è contenuta (chemical shift). Essa utilizza i segnali più deboli di altri nuclidi per ottenere informazioni quantitative e dinamiche su composti biochimici presenti nel tessuto in esame, e richiede una cultura squisitamente biochimica. I principali nuclidi d'interesse clinico che presentano il fenomeno della risonanza magnetica sono: il fosforo ( 31 P) e l'idrogeno ( 1 H) legati a molecole organiche, il carbonio ( 13 C), il sodio. L idrogeno ha sensibilità maggiore; si trova però gran parte legato all acqua, in concentrazione molto più elevata rispetto alle altre molecole organiche: il segnale di queste, pertanto, viene soffocato ; per evitare questo problema, si satura la risonanza dell acqua sommandovi una risonanza ad essa negativa: il picco viene così abbassato. In single voxel si analizza un unico cubetto di tessuto con una risoluzione spaziale di circa 1 cm 3 ; in multi voxel si analizzano invece molti cubetti, con una risoluzione spaziale inferiore al cm 3, costituendo una sorta di reticolato. I picchi degli elementi contenuti nel nucleo o nei mitocondri sono poco definiti a causa degli impedimenti di movimento; lo strumento generalmente li elimina per evidenziare solo quelli citoplasmatici. Recentemente sono state sviluppate altre metodologie di spettroscopia RM per lo studio della biochimica in vivo e tuttora in grande sviluppo: la spettroscopia di diffusione (d-rm) e la risonanza magnetica funzionale (f-mr). Spettroscopia di diffusione Con la spettroscopia di diffusione (d-mr) è possibile misurare in vivo in modo non invasivo la mobilità intra- ed extra-cellulare di molecole specifiche grazie alla naturale sensibilità della risonanza magnetica al moto delle molecole. In un mezzo isotropico (omogeneo), il coefficiente di diffusione D (cm 2 s -1 ) descrive il cammino libero medio del 1 H dell acqua, ed è espresso dal rapporto tra flusso (J s ) e gradiente di concentrazione del soluto J s = D dc dx Nei tessuti il coefficiente di diffusione è definito ADC (Coefficiente di Diffusione Apparente) poiché rappresenta la sommatoria della diffusione pura, dei flussi locali, della compartimentazione cellulare, dei processi di assorbimento, di trasporto, ecc. Si possono ottenere immagini pesate in diffusione (DWI) che dipendono da direzione e intensità del gradiente, T2, ecc., con significato clinico non indicativo. Si può calcolare il valore medio del ADC per ogni singolo pixel ed estrarre il valore medio di ADC da una qualunque regione d interesse definita a piacere sull immagine anatomica. 27

28 Nelle patologie cerebrali il valore di ADC della molecola dell'acqua cambia in seguito ad alterazioni della struttura e/o della funzionalità neuronale e/o assonale e del compartimento extraneuronale (glia e spazio extra-cellulare). Ad esempio, si riscontra un aumento del valore di ADC dell acqua nell edema vasogenico nella fase sub-acuta dell infarto cerebrale. Risonanza magnetica funzionale Con la risonanza magnetica funzionale (f-mr), grazie ad una risoluzione temporale di pochi secondi ed una rilevante risoluzione spaziale, è possibile seguire le rapide variazioni metabolico/funzionali correlate a componenti specifiche dei processi mentali, sfruttando la variazione del campo magnetico indotta dall'emoglobina ossigenata che aumenta grazie alla vasodilatazione che si ha in un'area cerebrale attivata. Con la spettroscopia RM del fosforo ( 31 P-MRS) si individuano e quantificano: ATP fosfato inorganico (Pi) fosfocreatina (PCr) Fosfo-monoesteri PME (intermedi mono-fosfati della glicolisi) (fosforilcolina, fosforiletanolamina); fosfo-diesteri PDE (glicerofosfocolina, glicerfosfoetanolamina) concentrazione di Mg2+ ph intracellulare Conoscendo la concentrazione intracellulare di queste molecole si valuta la funzionalità di diverse vie metaboliche quali: fosforilazione ossidativa glicogenolisi glicolisi trasporto del fosfato dal citosol al mitocondrio trasporto del protone dal citosol allo spazio extracellulare Con la spettroscopia RM del protone ( 1 H-MRS) si individuano e quantificano: n-acetilaspartato (NAA) colina (Cho) creatina + fosfocreatina (Cr, PCr) glutammato e glutammina (Glx, Gln) GABA mio-inositolo (m-i) acido lattico (LA) Conoscendo la concentrazione intracellulare di questi metaboliti si valuta la funzionalità di diverse vie metaboliche quali: sistema glutamminergico e GABAergico metabolismo energetico osmoregolazione del SNC cellularità neuronale e gliale 28

29 LA SPETTROSCOPIA 1 H-MRS NELLA DIAGNOSI DELLE MALATTIE DEL SNC Informazioni ottenibili da un indagine di spettroscopia RM cerebrale: Malattie neurodegenerative ed encefalopatie metaboliche acquisite Identificazione di alterazioni specifiche per sede o pattern spettrale utili per l orientamento diagnostico in presenza di un quadro morfologico negativo/aspecifico Lesioni focali identificate all indagine morfologica Diagnosi differenziale tra processo proliferativo, infettivo o ischemico Grading ed risposta alla terapia del processo proliferativo Difetti congeniti del metabolismo Identificazioni di specifiche alterazioni metaboliche Quantificazione dell entità del danno parenchimale Danno anosso-ischemico Integrità ed estensione del danno parenchimale Prognosi /planning terapeutico Sclerosi Multipla Entità del danno infiammatorio/assonale Biomarkers in trial farmacologici Chirurgia dell epilessia farmacoresistente Localizzazione del focolaio epilettogeno Con la spettroscopia RM del protone ( 1 H-MRS) nel cervello si individuano e quantificano: mio-inositolo (m-i), indicatore dell osmolarità; lega grandi quantità di acqua ed è più concentrato nel bambino rispetto all adulto shillo-inositolo (s-i), indicatore della funzionalità di membrana colina (Cho), marker gliale; concentrata soprattutto nei nuclei della base (più sensibili a variazioni della po 2 e ad agenti tossici), ce n è di più nell adulto. Proviene principalmente da intermediari del metabolismo dei fosfolipidi come la fosfo-cho e la glicerofosfo-cho, ciascuna delle quali gioca un ruolo importante nella struttura e nella funzione delle cellule di membrana. Conseguentemente l incremento della Cho può essere riscontrato in processi di elevato turnover cellulare di membrana come la proliferazione tumorale o lo sviluppo dell encefalo ma anche in processi di disfacimento e degradazione delle membrane secondari a qualsiasi noxa patogena. creatina (Cr) e fosfocreatina (PCr), è considerata un indicatore del metabolismo energetico. Poiché la Cr è abbastanza costante in varie condizioni metaboliche, essa è spesso usata come riferimento interno standard per la valutazione semi-quantitativa di altri metaboliti cerebrali. Quando presente, la modificazione del picco della Cr riflette il particolare assetto del metabolismo basale delle cellule neoplastiche il quale, sfruttando prevalentemente la via glicolitica, reprime in parte l attività enzimatica della creatin-chinasi, riducendo la concentrazione cellulare del complesso Cr/PCr. Vi sono tumori come i meningiomi e le metastasi che sono caratterizzati da una drastica riduzione del segnale della Cr poiché mancano completamente del complesso enzimatico Cr-PCr-chinasi. glutammato (Glx) e glutammina (Gln), soluzione non risolta di Glu e Gln, che indica lo stato della funzionalità di trasmissione n-acetilaspartato (NAA), è generalmente riconosciuto con marker dei neuroni e delle loro componenti inclusi i dendriti, per cui quando il tessuto cerebrale è danneggiato o è sottoposto ad un processo distruttivo, degenerativo o infiltrativo esso si riduce marcatamente. Le lesioni extraassiali che non abbiano infiltrato il cervello o che non contengano tessuto neurogliare non mostrano alcuna risonanza di NAA. GABA acido lattico (Lac), indicatore del metabolismo energetico. Nel bambino è fisiologicamente 29

30 presente, mentre nell adulto è sintomo di patologia: normalmente non è misurabile nel cervello perché la sua concentrazione è inferiore ai limiti di sensibilità della MRS; è prodotto attraverso la glicolisi anaerobia ed indica condizioni tossiche come un consumo ipermetabolico di glucosio. La sua presenza è rilevabile in presenza di molteplici cause, accomunate dalla indisponibilità cellulare di O 2 (aumento del metabolismo basale,deficit della perfusione, deficiente deflusso vascolare venoso, con conseguente accumulo di Lac per meccanismo di sequestro soprattutto nel contesto di componenti cistiche o necrotiche), ma è anche dovuta ad alterazioni enzimatiche mitocondriali: una distribuzione omogenea dell acido lattico, verificabile in multi voxel, indica con tutta probabilità tale evenienza. Ne consegue che, pur essendo un metabolita di frequente riscontro nello studio dei tumori, contrariamente a quanto segnalato da alcuni autori, non fornisce indicazioni sul grado di malignità cellulare. lipidi (Lip), indicatori del metabolismo lipidico. Conoscendo la concentrazione intracellulare di questi metaboliti si valuta la funzionalità e cellularità neuronale e gliale, l'osmoregolazione del sistema nervoso centrale, la funzionalità delle membrane biologiche, oltre a diverse vie metaboliche quali quelle del sistema glutamminergico e GABAergico e del metabolismo energetico. Importanti aspetti tecnici delle indagini 1 H-MRS cerebrali: Rapporto segnale/rumore Dimensioni del volume di tessuto studiato Durata dell esame Omogeneità del campo magnetico: una bassa omogeneità di campo magnetico aumenta proporzionalmente l errore nella quantificazione dei metaboliti Aree cerebrali che soffrono di bassa omogeneità: Regione frontale Regione temporale Gangli della base (depositi di Ferro) Midollo cervicale Artefatti da movimento Pazienti di età < 6 anni Pazienti adulti non collaboranti Sedazione / anestesia generale: collaborazione con Radiologia pediatrica, Anestesiologia Criteri per definire anormale il contenuto di un metabolita: ± 2 d.s. da valori di riferimento ottenuti in popolazione di controllo di età paragonabile sulle stesse aree cerebrali da spettri con paragonabile rapporto segnale/rumore da spettri con paragonabile omogeneità di campo Demenze degenerative: sono alterazioni neurometaboliche. Lo studio dei metaboliti neuronali ha permesso di dimostrare che sono colpite alcune particolari regioni cerebrali, che consentono di fare diagnosi differenziale tra i diversi quadri specifici delle patologie: Ippocampo Lobo temporale mesiale Giro del cingolo anteriore Giro del cingolo posteriore Talamo Malattia di Alzheimer: la 1 H-MRS mostra anomalie in soggetti pre-sintomatici, ovvero pazienti che presentano mutazioni in Precursore della Proteina Amiloide (PPA), Presenilina 1 (PS1), o Presenilina 2 30

31 (PS2) sono destinati a sviluppare Malattia di Alzheimer. Dall'esame risultano la diminuzione di NAA e l'aumento di mi nel giro del cingolo posteriore. Mild cognitive impairment (MCI) e Malattia di Alzheimer: MCI comprende un gruppo eterogeneo di pazienti caratterizzati da deficit cognitivi selettivi: 10-15% dei casi di MCI sviluppano Alzheimer (1-2% degli anziani sani sviluppano Alzheimer). La 1 H-MRS cerebrale permette l'identificazione di soggetti Alzheimer-responders alla terapia con donezepil da avviare a trattamento Ippocampo: alterazioni 1 H-MRS simili in Alzheimer e MCI Cingolo posteriore: alterazioni solo in Alzheimer Atassia di Friedreich: La diminuzione di NAA quantifica l'estensione della neurodegenerazione cerebellare. Malattie da prioni: un gruppo eterogeneo di patologie, dove però alla 1 H-MRS le forme acquisite (Kuru, vcjd, CJD iatrogeno) sono assimilabili alle forme sporadiche (scjd, sfi). Encefalopatia epatica: il fegato non è in grado di eliminare l ammoniaca producendo urea; l ammonio è in grado di oltrepassare la barriera ematoencefalica, interagendo, a livello del SNC, con gli α-chetoacidi Glutamato deidrogenasi: NH α-chetoglutarato = glutammato (neurotrasmettitore tonico) Glutammina sintetasi: NH glutammato + ATP = glutammina + ADP + P i + H + piruvato alanina ossalacetato aspartato Tutti questi metaboliti vengono così sottratti al Ciclo di Krebs. Inoltre, la glutammina ha effetto iperosmotico, e viene scambiata con l'inositolo che quindi diminuisce. Lesioni focali: spesso la radiologia non riesce a distinguere se una lesione è tumorale o no, né ad indicarne il grado. La 1 H-MRS è quindi utile per: Diagnosi differenziale tra lesione tumorale e non-tumorale Definizione del grado ed aggressività del tumore Guida per biopsia cerebrale Valutazione della risposta a terapia non chirurgica Diagnosi differenziale tra rediciva e radionecrosi Il marker tumorali sono l'aumento della colina, conseguente all'aumento del metabolismo nelle cellule tumorali, e l'aumento del lattato, proporzionale all'aggressività del tumore ed al divario tra l'alto metabolismo e la lenta neovascolarizzazione. Diagnosi differenziale tra ascessi cerebrali e tumori necrotici: l inclusione del ring assumente contrasto non evidenzia normali metaboliti, ed in particolare colina. Compaiono metaboliti (succinato a 2.4 ppm, acetato a 1.9 ppm, aminoacidi a 0.9 ppm) Succinato e acetato sono i prodotto finali del metabolismo batterico 31

32 AA (valina, leucina e isoleucina) derivano dalla proteolisi dei microorganismi e polimorfonucleati neutrofili Può essere presente accumulo di lattato e lipidi indicativo di danno necrotico Encefalomiopatie mitocondriali: un ampio spettro di fenotipi clinici, a carattere multisistemico, dovuti a patologie ereditarie o sporadiche della funzione respiratoria mitocondriale. oftalmoplegia esterna progressiva (CPEO) neuropatia ottica ereditaria di Leber (LHON) miopatie mitocondriali (MM) encefalomiopatie mitocondriali (MEM) epilessia mioclonica con RRF (MERRF) retinite pigmentosa mitocondriale (MTRP) encefalomiopatia mitocondriale con acidosi lattica e episodi stroke-like (MELAS) L'aumento di lattato è un marker facilmente evidenziabile nel parenchima cerebrale perché è misurabile nel LCR dei ventricoli laterali. Metabolita Aumentato in Diminuito in Lattato Ipossia, anossia, ictus, ipoventilazione, idrocefalo NAA Ritardo nello sviluppo, ipossia, anossia, ischemia, idrocefalo, epilessia, neoplasie, ictus, idrocefalo, Alzheimer Glx Encefalopatia epatica, ipossia Alzheimer mi Alzheimer, diabete, ipossia (recupero), stati iperosmolari HE, encefalopatia ipossica, ictus, tumori Cr Traumi, iperosmolarità Ipossia, ictus, tumori, infanzia Cho Trauma, diabete, trapianto epatico, tumori, ipossia, Alzheimer HE, patologie epatiche, demenza aspecifica SPETTROSCOPIA RM DEL FOSFORO ( 31 P-MRS) NEL MUSCOLO SCHELETRICO Con la spettroscopia MR del fosforo ( 31 P-MRS) nel muscolo scheletrico si individuano e quantificano: monosaccaridi fosforilati (PME) fosfato inorganico (P i ) intermedi metabolici fosforilati (PDE) fosfocreatina (PCr) ATP concentrazione di Mg 2+ ph intracellulare. Conoscendo la concentrazione intracellulare di queste molecole si valuta la funzionalità di diverse vie metaboliche quali: fosforilazione ossidativa, glicogenolisi, glicolisi, trasporto del fosfato dal citosol al mitocondrio, trasporto del protone dal citosol allo spazio extracellulare. A partire dalle concentrazioni misurabili si calcolano : 1. ph: funzione della concentrazione di P i e magnesio 2. Mg 2+ : funzione della concentrazione di ATP (il magnesio lega, con le sue due cariche, l ATP, soprattutto il β, modificandone lo spettro di risonanza), Pcr, P i (il tasso di magnesio libero è un indicatore della funzionalità mitocondriale: se questa decresce, avremo una diminuzione della PCr e un parallelo aumento del Pi: questo lega Mg con maggiore affinità rispetto ad ATP, causandone dunque una drammatica diminuzione) e del ph. 32

33 [Cr][ ATP] 3. ADP: [ ADP] = k Cr [ PCr ][ H + ] in concentrazione μmolare, non è calcolato dalla spettroscopia ma basandosi sulla legge di Michaelis-Menden 4. V max : V max = V 1 K m [ ADP] in mmol di ATP al minuto Prova da sforzo Aumentando l intensità e la durata del lavoro, diminuisce man mano la PCr aumentando il P i, indice di consumo d energia a rapida fornitura : ATP + H 2 O ADP + Pi + E ADP + PCr Cr + ATP glucosio lattato (abbassamento del ph) Il recupero è rapido, caratterizzato dalla respirazione mitocondriale, dalla glicogenolisi, dalla glicolisi e dal trasporto del P i nel mitocondrio. Il ph continua a diminuire anche dopo la fine dell'esercizio a causa della risintesi della fosfocreatina, e torna a livelli normali grazie a pompe trasportatrici, che funzionano proporzionalmente alla perfusione capillare; essendo il carrier mitocondriale di P i dipendente dal ph (che è di 8 nella matrice) e avendo K m per P i bassa, la velocità di recupero è inversamente proporzionale al valore del ph. Riposo Esercizio Recupero Concentrazione di PCr, Pi, ATP; ph ph; PME; produzione di lattato Produzione mitocondriale di ATP; efflusso di protoni dalla cellula; velocità di risintesi di fosfocreatina Distrofie muscolari, Miositi (PM, DM, IBM), Miopatie mitocondriali, Glicogenosi Glicogenosi, Difetti nel metabolismo degli acidi grassi, Miositi (PM, DM) Miopatie mitocondriali, Miositi (PM, DM) Patologie muscolari primitive: markers diagnostici 1. Glicogenosi muscolari 2. Miopatie mitocondriali 3. Distrofie muscolari 4. Distrofie miotoniche 5. Miosite a corpi inclusi 6. Poli- e dermatomiositi 1 Malattia Anomalie aspecifiche Anomalie caratteristiche Carenza di miofosforilasi 2 Carenza di PFK A riposo: alte PCr e ATP In esercizio: rapida deplezione di PCr Recupero: lento recupero di Pcr e ADP Recupero: lento recupero di PCR, ADP e Pi Alcalosi con esercizio moderato; nessun picco di PME nell esercizio Alcalosi, marcato picco PME, perdita di ATP; lento recupero di PME 33

34 3 Distrofia di Duchenne 4 Distrofia miotonica 5 Miosite a corpi inclusi 6 Dermatomiosite/ polimiosite A riposo: PCr bassa; Pi, ADP, PDE e ph alti In esercizio: rapida deplezione Pcr; poca acidificazione Recupero: lento recupero P i A riposo: P i e ADP alti; PCr e PP bassi In esercizio: eccessiva deplezione di PCr ridotta acidificazione Recupero: P i, ph e ADP alti; PCr e PP bassi A riposo: PCr e ATP basse; P i alto In esercizio: eccessiva deplezione di Pcr; ridotta acidificazione Recupero: PCr, ADP normali Lento recupero di PCr Recupero PCr e ADP, e V max normali Lento recupero di PCr associato a lenta estrusione protonica Diagnosi di glicogenosi muscolare con 31 P-MRS Le glicogenosi sono patologie ereditarie causate da difetti negli enzimi coinvolti nella sintesi o nella degradazione del glicogeno, che si accumula in quantità eccessiva o in forme anomale; gli organi più colpiti sono il fegato (epatomegalia ed ipoglicemia), il muscolo (debolezza progressiva, intolleranza allo sforzo e crampi). Il glicogeno è la principale fonte di glucosio per la glicolisi; in condizioni aerobie il prodotto finale della glicolisi è il piruvato che entra nel ciclo di Krebs. Gli equivalenti riducenti generati nella glicolisi sono trasferiti via NADH alla catena respiratoria mitocondriale. In condizioni anaerobie il NADH generato è riossidato a NAD + dalla riduzione del piruvato a lattato da parte dall enzima LDH. Non tutti gli enzimi il cui deficit è responsabile di GM sono coinvolti nella produzione di energia (ad es. deficit di maltasi acida). Nel test muscolare ischemico si effettuano diversi prelievi: stato basale, ed 1, 2, 5 e 15 min. dopo un esercizio ischemico di durata massima 2 di flessione dei muscoli delle dita. Si valutano il lattato (glicolisi) e l ammonio (adenilato de-aminasi). Durante l esercizio ischemico non avviene la fosforilazione ossidativa e viene utilizzato ADP per produrre energia. Nei soggetti sani le variazioni di lattato ed ammonio sono consensuali; nei pz. con glicogenosi, non funzionando la glicogenolisi, non viene prodotto lattato, ma l ammonio aumenta molto, proporzionalmente all'intensità dell'esercizio svolto. Nella spettroscopia RM del fosforo 31 P-MRS intramuscolare si valutano la concentrazione dei metaboliti fosforilati ed il ph a riposo, il ph e gli intermedi monofosfati della glicolisi (intermedi metabolici fosforilati PME) durante l esercizio, la velocità di risintesi di fosfocreatina post-esercizio. Glicogenosi di tipo V (Malattia di McArdle) - deficit enzimatico: glicogeno fosforilasi ridotta [ATP] a riposo assenza di acidificazione mancato aumento dei PME durante l esercizio muscolare lenta risintesi di PCr nel post-esercizio. 34

35 Glicogenosi di tipo II (Malattia di Pompe) - deficit enzimatico: maltasi acida alterazioni a riposo: [PCr], [Pi] normale acidificazione durante esercizio normale risintesi di PCr nel post-esercizio Glicogenosi di tipo VII (Malattia di Tauri) - deficit enzimatico: fosfofrutto kinasi ridotta [ATP] a riposo assenza di acidificazione marcato aumento dei PME durante l esercizio muscolare lenta risintesi di PCr nel post-esercizio. SPETTROSCOPIA RM DEL FOSFORO ( 31 P-MRS) NEL CERVELLO Con la spettroscopia MR del fosforo ( 31 P-MRS) nel cervello si individuano e misurano: intermedi metabolici fosforilati della biosintesi dei fosfolipidi (PME) fosfato inorganico (P i ) intermedi metabolici fosforilati del catabolismo dei fosfolipidi (PDE) fosfocreatina (PCr) ATP SPETTROSCOPIA RM DEL FOSFORO ( 31 P-MRS) NEL CUORE Con la spettroscopia MR del fosforo ( 31 P-MRS) nel miocardio si individuano e quantificano: fosfocreatina (Pcr) ATP concentrazione di Mg 2+ intermedi metabolici fosforilati (PME) La riga di risonanza definita 2,3-DPG è dovuta all acido-2,3-difosfoglicerico contenuto nei globuli rossi che transitano nelle cavità cardiache. Conoscendo la concentrazione intracellulare di queste molecole si valuta la funzionalità della respirazione mitocondriale (fosforilazione ossidativa), quindi la capacità del miocardio a rispondere agli stress. 35

36 LA DIAGNOSI DEL CARCINOMA PROSTATICO Il cancro della prostata rappresenta la seconda neoplasia più frequente nei paesi occidentali. Ogni anno si osservano più di nuovi casi negli USA e più di in Europa. Modalità di presentazione del carcinoma prostatico: Manifesto: clinicamente evidente Incidentale: post adenectomia PSA Occulto: metastasi in assenza di obiettività prostatica Latente: reperto autoptico I carcinomi si localizzano nella zona periferica per il 70%, nella zona di transizione per il 30%. Approccio clinico al sospetto Ca.P. La diagnosi differenziale tra ipertrofia benigna e adenocarcinoma si effettua tramite diverse metodiche: 1. esame clinico: esplorazione rettale (DRE) 2. esame di laboratorio: PSA 3. ecografia transrettale (TRUS) 4. biopsia: se positiva: stadiazione del carcinoma; se negativa: re-biopsia, follow-up 5. 1 H-MRS PSA (antigene prostatico specifico): utilizzato come marcatore tumorale nella diagnosi del carcinoma prostatico e nel monitoraggio di malattia dopo terapia. I livelli sierici di PSA si elevano nelle malattie prostatiche sia benigne (ipertrofia, infiammazioni) che maligne. Il PSA è una glicoproteina circolante, della famiglia delle serin-proteasi, dotata di attività enzimatica proteolitica, composta da 237 aminoacidi, con peso molecolare di 33 kd. Nel soggetto normale è presente nel siero in concentrazione di 2,5-4 ng/ml, in due forme principali enzimaticamente inattive: per il 10% come PSA Libero (non legato ad altre molecole) ed il restante come PSA Coniugato (legato ad inibitori delle proteasi), di cui il 65-95% legato ad α1-antichimotripsina (ACT-PSA), poi legato ad α2- macroglobulina (AMG-PSA) e ad α1-inibitore delle proteasi (API-PSA). È secreto quasi esclusivamente dalle cellule epiteliali degli acini e dei dotti della ghiandola prostatica, in risposta allo stimolo ormonale degli androgeni. È prodotto sia in condizioni normali che dalla cellula tumorale, ed ha la funzione di fluidificare il liquido seminale. I sistemi di dosaggio immunoenzimatico (MEIA) sono in grado di caratterizzare le varie forme di PSA in circolo: PSA libero, ACT-PSA, PSA totale (PSA libero + ACT-PSA). Il laboratorio deve segnalare nel referto il metodo di dosaggio utilizzato. Valori di PSA ottenuti con dosaggi diversi non possono essere interscambiati, per cui nel monitoraggio di un dato paziente è consigliabile far eseguire gli esami sempre nello stesso laboratorio. La forma libera del PSA è prevalente nel siero di pazienti con ipertrofia prostatica benigna; il rapporto PSA libero/totale amplifica la sensibilità diagnostica del PSA nel distinguere il cancro dalla ipertrofia prostatica. Limiti: Accuratezza diagnostica non ottimale per bassa specificità (Sensibilità 89-97%, Specificità 10-65%) Variabilità dei metodi di dosaggio: difficoltà nella scelta del cut-off ottimale (< 15 % il più accettato) Ha bassa stabilità in vitro (tendenza a degradarsi a temperatura ambiente ed a 4 C) La forma coniugata del PSA è prevalente nel siero di pazienti affetti da cancro prostatico. Richiede la misura di un singolo analita: vantaggio economico rispetto alla misura del rapporto 36

37 PSA libero/psa totale. È molto più stabile in vitro del PSA libero. Limiti: Non sembra fornire un accuratezza diagnostica significativamente superiore a quella del PSA totale (Sensibilità: 85-95%, Specificità: 11-54%) La misura del rapporto PSA coniugato/psa totale migliora la performance diagnostica del PSA totale, ma in modo sovrapponibile al rapporto PSA libero/psa totale. Il valore soglia tradizionalmente accettato (4 ng/ml) per l esecuzione della biopsia prostatica ha una sensibilità 80% (20% di tumori non identificati) ed una specificità 60% (40% di biopsie non necessarie): non ha una accuratezza diagnostica soddisfacente per la neoplasia prostatica. Non solo il PSA è spesso aumentato in assenza di neoplasia, ma il 15% dei soggetti tra 65 e 91 anni PSA-negativi sono portatori di neoplasia: il problema è la fascia grigia tra 4 e10 ng/ml. Ridurre la soglia del PSA sotto i 4 ng/ml raddoppierebbe il numero di biopsie non necessarie ed aumenterebbe il riscontro di tumori clinicamente non significativi. Non esistono indicazioni univoche e condivise circa l'orientamento diagnostico del test PSA: i principali quesiti aperti riguardano livello/i soglia e test da associare (derivati del PSA). Approcci in uso per migliorare l accuratezza dell orientamento diagnostico: PSA Density: PSA espresso in rapporto al volume della prostata determinato ecograficamente. Razionale: differente tasso di rilascio del PSA da parte del cancro (3.0 ng/g) e della IPB (0.3 ng/g) per unità di massa di tessuto. Fattori limitanti l accuratezza diagnostica: Il volume prostatico ed il PSA aumentano in modo diverso con l età Il rapporto epitelio/stroma presenta una consistente variabilità inter-individuale La valutazione ecografica del volume prostatico è soggetta ad imprecisione PSA Velocity: PSA espresso come variazione percentuale in un dato intervallo temporale. Razionale: differente tasso di rilascio del PSA da parte del cancro (3.0 ng/g) e della IPB (0.3 ng/g) per unità di massa di tessuto nel tempo. Fattori limitanti l accuratezza diagnostica: Variabilità inter-individuale degli incrementi Imprecisione analitica Variazione considerata significativa per neoplasia: 0.75 ng/ml (corrisponde ad una variazione di PSA non significativamente diversa dalla variabilità analitica: imprecisione caratteristica del metodo di dosaggio) Intervalli di riferimento aggiustati per età: valori soglia diversi per diverse fasce di età. Razionale: progressivo innalzamento dei livelli di PSA con l età 37