Elementi di Micologia

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1 Elementi di Micologia I anno - Laurea Magistrale Farmacia Jean-Denis Docquier Laboratorio di Fisiologia e Biotecnologia dei Microrganismi Dipartimento di Biologia Molecolare Policlinico "Le Scotte", Viale Bracci, II piano, V lotto Tel [email protected]

2 Recupero lezioni Prof. Zazzi: 3 giugno, 9-11, aula 9 4 giugno, 9-11, aula 12 Appelli di esame (aula informatica): 19 giugno, luglio, luglio, settembre, settembre, 9-14.

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4 Completa mancanza di tessuti differenziati e elementi conduttori Sistema riproduttivo attraverso elementi detti spore e non attraverso uno stadio embrionale come avviene per piante e animali

5 eucarioti immobili chemiosintetici eterotrofi (mancano di clorofilla e sono dipendenti dei composti organici per la nutrizione) parete cellulare rigida uni o pluricellulari si riproducono per mezzo di spore aerobi (facoltativi) parassiti, saprofiti e simbionti Ubiquitari in natura: negli strati superficiali del suolo come commensali di animali e piante TALLO: corpo vegetativo di un fungo

6 Penicillium italicum: muffa verde-blu che fa marcire le arance Penicillum notatum e Penicillium chrysogenum, ed un suo metabolita, la penicillina, hanno consentito a Fleming nel 1928 di anticipare l era antibiotica Un lievito, Saccharmyces cerevisiae, è stato utilizzato fin dai tempi più remoti per processi alimentari come la lievitazione del pane, la fermentazione del vino e della birra Penicillium camemberti e P. rocqueforti giocano un ruolo fondamentale nella manufattura dei formaggi di tipo Camembert, Brie e Roquefort Il Tolypocladium niveum produce clicloserina, un immunosoppressore utilizzato nella terapia della sclerosi e nei trapianti e alcuni lieviti vengono utilizzati in ingegneria genetica per la produzione di insulina

7 Aggregati PLURICELLULARI Funghi filamentosi o MUFFE Ife non settate IFE Ife settate L insieme delle IFE viene detto MICELIO

8 Micelio AEREO: Strutture specializzate alla riproduzione Conferisce l aspetto tipico della colonia Micelio VEGETATIVO: Assorbimento di materiale nutritizio dal terreno

9 UNICELLULARI Miceti lievitiformi o LIEVITI

10 Dimensioni > cellula batterica < cellula animale

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12 LA CELLULA FUNGINA reticolo endoplasmico complesso di Golgi membrana plasmatica contenente ERGOSTEROLO mitocondri Capsula polisaccaridica (in alcuni casi) nucleo compartimentato con cromosomi lineari PARETE CELLULARE RIGIDA

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15 Mannoproteine b (1,6)-glucano b (1,3)-glucano Chitina (poli-nag) Membrana plasmatica ergosterolo Citoplasma Contiene ergosterolo Caratterizza la forma del micete Struttura pluristratificata Controlla lo scambio in livelli di con metaboliti particolari composizioni chimiche Proprietà con l ambiente antigeniche esterno Coinvolta nella sintesi della parete Media cellulare interazioni con la cellula ospite

16 I miceti si riproducono per mezzo di strutture specializzate: SPORE o CONIDI Due modalità di riproduzione: sessuata asessuata Le due forme possono essere presenti, escludersi o alternarsi nel ciclo vitale di un fungo con ritmi e frequenze diversi nelle varie specie

17 Riproduzione per GEMMAZIONE (budding yeasts): BLASTOGONIA Sistema in cui le cellule figlie compaiono come protuberanze dalla cellula madre dalla quale poi si distaccano diventando autonome, diversa dalla scissione perché avviene una ripartizione diseguale del citoplasma

18 Attraverso un processo mitotico vengono prodotte strutture specializzate denominate spore o conidi in grado di generare un nuovo individuo I conidi hanno il vantaggio di essere molto leggeri, altamente resistenti, facile disseminazione ambientale

19 Accrescimento longitudinale delle ife POTENZIALITA DI ESPANSIONE INFINITA

20 Conidiospore: i conidi si distaccano da un conidioforo posto su una ifa aerea Sporangiospore: le spore vengono prodotte all interno di un organo detto sporangioforo Artrospore: le spore sono prodotte per frammentazione delle ife vegetative Le spore asessuate possono essere:

21 La diversa morfologia dei conidi permette il riconoscimento delle varie specie di funghi filamentosi

22 Subordinata alla produzione di milioni di spore diffuse attraverso vento, acqua o insetti La spora sessuale di un determinato sesso nelle condizioni più favorevoli germina formando un filamento di cellule detto micelio primario Per poter completare il ciclo biologico e creare il micelio secondario l ifa primaria generata da una spora con carica maschile si unisce una a carica sessuale opposta per formare il micelio secondario che genererà i corpi fruttiferi

23 Spore sessuali: Zigospore Ascospore Basidiospore

24 Caratteristica peculiare di alcuni miceti patogeni Capacità, reversibile, di presentarsi morfologicamente distinti nella forma parassitaria o tessutale, in genere lievitiforme, e nella forma colturale o vegetativa, in genere filamentosa La conformazione è riferibile a: scarso adattamento dei miceti alle condizioni ambientali (es. temperatura) meccanismi di regolazione genica esercitati da temperatura, concentrazione ioni, variazioni ph

25 Abituali saprofiti, l infezione rappresenta un evento accidentale Molti prodotti considerati fattori di virulenza sono funzionali a scopi metabolici e riproduttivi Nelle muffe il meccanismo principale è l alta capacità di penetrazione nei tessuti e la capacità di adattarsi alle condizioni avverse dei tessuti parassitati

26 Resistenza alla fagocitosi: dimensioni del tallo fungino capacità di interferire con l attività fagacitaria per presenza di strutture cellulari antifagocitarie: mannani (C. albicans), a 1-3 glucano (Blastomyces dermatitidis, H. capsulatum, P. brasiliensis), capsula (Cryptococcus neoformans), recettori del complemento che inibiscono l opsonizzazione Adesività: meccanismi non specifici: forza idrofobiche, cariche elttrostatiche meccanismi specifici: interazione tra adesine e recettori (chitina, glucani, mannani: possibili adesine)

27 Pleomorfismo: pluralità di forme (dimorfismo) Produzione di enzimi idrolitici: proteasi (C. albicans), fosfolipasi, lipasi, serinproteasi (Aspergillus spp.), cheratinasi (dermatofiti), fenolo-ossidasi (Cryptococcus neoformans) Produzione di tossine: alcune interferiscono con la risposta immunitaria Candida albicans: canditossina, tossine a basso pm Aspergillus spp.: aflatossina, gliotossina, fumigatossina, restrictocina

28 Barriere meccaniche Sostanze antimicrobiche non specifiche Fagocitosi e killing intracellulare Immunità umorale e cellulo-mediata

29 Un numero limitato di funghi (generalmente dimorfici) possono causare malattia in soggetti altrimenti sani La maggior parte delle infezioni da funghi sono lievi ed autolimitanti Le specie fungine esplicano la patogenicità attraverso: Parassitismo diretto (micosi) Produzione di micotossine (intossicazioni micotossicosi) Intossicazioni alimentari da ingestione di funghi macroscopici velenosi (micetismo) Reazioni allergiche

30 Le micotossine possono esercitare effetti tossici acuti o cronici MICOTOSSINE DI INTERESSE UMANO Micotossine Effetto biologico Microrganismo Aflatossina Carcinogenesi epatica A. parasiticus, A. flavus Tricoteceni Antrachinoni Tossicità dermatologica; indebolimento del sistema immunitario; inibizione della sintesi proteica; effetto teratogeno Epatotossico, carcinogenesi epatica Citreoviridine Neurotossica Penicillium Naftochinoni Epatotossico Fusarium, Acremonium, Stachyobotris, Trichoderma, Trichothecium, Verticimonosporium Penicillium, Aspergillus Trychophyton, Penicillium viridicatum Ocratossine Inibizione della trna sintetasi Aspergillus, Penicillium Zearalenone Estrogenico, teratogeno Fusarium graminearum Cloropeptide Epatotossico, diminuisce la sintesi del glicogeno epatico Penicillium islandicum

31 Ne esistono numerosi tipi (B1, B2, G1, G2 e i loro derivati metabolici M1 ed M2). Sono fortemente sospettate di esplicare un azione tossica, mutagena e cancerogena a carico del fegato e tossica per il sistema immunitario Difficili da eliminare perché sono organismi estremamente termoresistenti Gli alimenti più esposti alla contaminazione sono i cereali (mais, frumento, riso, orzo, segale, ecc.) e derivati (farina e prodotti da forno, polenta ecc.), semi oleaginosi (arachidi,girasole, ecc.), frutta secca ed essiccata, legumi, spezie, caffé e cacao Le condizioni ideali per lo sviluppo dell aflatossina sono: 1. temperatura compresa tra 15 e 40 C (optimum C) 2. umidità relativamente elevata superire al 70% 3. ph i cui valori siano compresi tra 4 e 8 4. presenza di ossigeno

32 Candida spp. Cryptococcus neoformans Malassezia spp. Dermatofiti Aspergillus spp. Pneumocystis jirovecii (Pneumocystis carinii sp. f. hominis ) Miceti con dimorfismo temperatura-dipendente

33 Specie Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei Specie clinicamente più rilevante Altre specie clinicamente rilevanti Habitat: C. albicans: commensale umano distretti colonizzati: - cavo orale - intestino - vagina Altre specie: più frequentemente ambientali (acque, suolo, vegetali)

34 Nei terreni di coltura in genere cresce come LIEVITO Nei tessuti infetti sono possibili PSEUDOIFE e FORME FILAMENTOSE Candida albicans può essere considerata un micete dimorfo

35 Micete lievitiforme (cresce bene a C) Habitat: saprofita molto diffuso nell ambiente abbonda negli escrementi di piccione Provvisto di abbondante CAPSULA POLISACCARIDICA - fattore di virulenza - colonie di aspetto mucoide - evidenziabile con inchiostro di china

36 Miceti filamentosi ad ampia diffusione ambientale Caratteristica morfologia delle strutture conidiali Il genere Aspergillus comprende varie specie: Aspergillus fumigatus (la specie clinicamente più importante) Aspergillus niger Aspergillus flavus Distinguibili per caratteri macro- e microscopici

37 SPECIE SUPERFICIE VERSO A. clavatus Blu-verde Bianco, marrone con il tempo A. flavus Giallo-verde Dorato, marrone-rosso A. fumigatus Blu-verde al grigio Bianco fino al marrone A. glaucus Verde con aree gialle Giallo fino al marrone A. nidulans Verde, camoscio o giallo Rosso porpora fino a verde oliva A. niger Nero Bianco al giallo A. terreus Cannella fino al marrone Bianco al marrone A. versicolor Inizialmente bianco, vira poi al giallo, marrone-rosso, verde pallido o rosa Bianco al giallo o rosso porpora A. flavus Aspergillus niger Aspergillus fumigatus

38 VANTAGGI: - rapidità - semplicità esame microscopico a fresco esame microscopico dopo colorazione di Gram esame microscopico dopo colorazione con lattofenolo esame microscopico dopo colorazione con inchiostro di china esame microscopico dopo colorazione con calcofluor

39 TERRENI DI COLTURA Non selettivi Sabouraud dextrose agar: ph 5.6 favorisce la crescita dei miceti invece che dei batteri SAB Heart infusion (SABHI): arricchito di nutrienti, adatto per Blastomyces e Histoplasma Potato dextrose Selettivi Mycosel (SAB con antibiotici): cloramfenicolo; cyclohexamide inibiscono la crescita dei saprofiti Chromagar: terreno cromogenico per lieviti Czapek agar: usato nella coltivazione dei microrganismi capaci di utilizzare nitrogeno inorganico; raccomandato per l isolamento di Aspergillus e Penicillium Corn meal agar

40 Sabauraud dextrose agar Czapek Terreno cromogeno per lieviti

41 LIEVITI mediante terreni cromogenici mediante test biochimici MUFFE Identificazione microscopica in base ai conidi e conidiofori

42 Sensititre: MIC in microdiluizione E-test: MIC in agar diffusione

43 Caratteristiche di un antifungino ideale: Bersaglio selettivo Attività fungicida Elevata potenza Ampio spettro Bassa tossicità Scarse o assenti interazioni farmacologiche

44 Disponibili in numero molto minore degli antibatterici - più difficile trovarne data la natura eucariotica della cellula fungina - l impatto delle infezioni fungine è minore di quello delle infezioni batteriche Antibiotici POLIENICI Chemioterapici AZOLICI Allilamine Griseofulvina 5'-Fluorocitosina Echinocandine

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46 Amfotericina B (uso sistemico) Nistatina (uso topico) Il numero di doppi legami coniugati è direttamente proporzionale all attività antifungina e inversamente proporzionale alla tossicità in cellule di mammifero. I comporti con 7 doppi legami, come l amfotericina B, non solo sono circa 10 volte più tossici per la cellula fungina, ma sono gli unici che possono essere impiegati per terapie sistemiche nell uomo

47 Meccanismo di azione: legame a membrane contenenti ergosterolo formazione di canali transmembranari (effetto permeabilizzante) Relativa nefrotossicità (Amfotericina B) (migliorata dalle formulazioni liposomiali) Amfotericina B è pochissimo solubile in acqua. Complessata con acido desossicolico per somministrarla ev. Più recentemente formulazioni complessate con lipidi e incapsulate in liposomi ne hanno diminuito la tossicità e permettono di avere livelli plasmatici più elevati del farmaco

48 SQUALENE Squalene epossidasi Squalene epoxide ALLILAMINE: Naftifina Terbinafina LANOSTEROL Lanosterolo 14-alpha demetilasi 14-alpha-demethyl lanosterol Zymosterol AZOLI: Ketoconazolo Fluconazolo Itraconazolo Voriconazolo Fecosterol ERGOSTEROL

49 Caratterizzate dalla presenza di un gruppo allilaminico (naftifina e terbinafina) Butenafina e tolnaftato vengono annoverati in questa classe anche se hanno struttura diversa perché accomunati dallo stesso meccanismo d azione

50 Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo bersaglio: SQUALENE EPOSSIDASI Indicazioni: micosi cutanee e degli annessi (Dermatofizie) (il farmaco si concentra nella cute e negli annessi)

51 Gli azoli sono classificati come: 1. imidazoli se possiedono due atomi di azoto nell anello azolico (ketoconazolo) 2. triazoli se contengono tre atomi di azoto (fluconazolo, itraconazolo e voriconazolo, posaconazolo e ravuconazolo)

52 Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo bersaglio: LANOSTEROLO DEMETILASI I triazoli hanno tossicità minore degli imidazoli a causa della loro maggiore specificità per i citocromi P450 fungini rispetto a quelli delle cellule di mammiferi

53 Ridotta permeabilità che impedisce l ingresso del farmaco nella cellula Aumentata produzione enzima bersaglio Erg11p per incrementata espressione del gene codificante ERG11 Alterazioni enzima bersaglio per mutazioni che ne diminuiscono l affinità con gli azoli Pompe da efflusso che estrudono il farmaco e non ne permettono l accumulo, sono pompe do tipo ABC trasporter

54 Meccanismo di azione: Trasportato all interno della cellula ad opera dell enzima citosina permeasi Inibizione della sintesi degli acidi nucleici Inibizione della sintesi proteica 5-FLUOROCITOSINA Citosina deaminasi Uridina monofosfato fosforilasi 5-FLUORODESOSSIURIDINA MONOFOSFATO Inibitore della timidilato sintetasi, enzima chiave nella sintesi del DNA 5-FLUOROURACILE 5-FLUOROURIDINA TRIFOSFATO incorporato nel RNA della cellula fungina e determina inibizione della sintesi proteica > Bassa tossicità > Frequente l insorgenza di resistenza a causa di mutazioni a carico dei tre enzimi chiave

55 Meccanismo di azione: Si pensa che si leghi con la proteina tubulina, interferendo con il corretto funzionamento del fuso mitotico e quindi interferisca con la divisione cellulare Indicazioni: micosi superficiali delle unghie

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57 Ergosterolo Meccanismo di azione: inibisce specificatamente la sintesi del b-1-3-dglucano, componente essenziale per l integrità della parete; provoca un aumentata permeabilità della parete e la conseguente lisi della cellula Cryptococcus neoformans non risulta sensibile Zygomycetes sono naturalmente resistenti