Metodi di indagine delle cellule e dei tessuti: Esame a fresco Tecnica delle fette
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- Dorotea Zamboni
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1 Metodi di indagine delle cellule e dei tessuti: Esame a fresco Tecnica delle fette
2 Esame a fresco Viene utilizzato per l osservazione di : Cellule viventi Frammenti di tessuti (dopo dissociazione) Microoganismi in genere l esame a fresco richiede l utilizzo del microscopio a contrasto di fase
3 Dissociazione di cellule e tessuti Dissociazione meccanica mediante aghi, pestaggio (colini-setacci) centrifugazione
4 Dissociazione chimica. Alcune strutture fibrose si isolano più facilmente per dissociazione se il tessuto è stato previamente sottoposto a macerazione con sostanze chimiche che, nella maggior parte dei casi, provocano alterazioni profonde a livello cellulare. a) acqua bollente b) Alcool al terzo di Ranvier (alcool a 95 e acqua distillata, 1: 2) c) Soda e potassa caustica al 30%: d) Acidi forti (ac. nitrico e ac. cloridrico ai 30 ac. solforico concentrato). e) Ac. picrico (sol. satura acquosa) f) Enzimi (tripsina, pepsina, papaina, jaluronidasi)
5 Microscopio a contrasto di fase È un tipo particolare di microscopio che analogamente al microscopio a luce trasmessa lavora nel campo del visibile. Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa. Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso a livello del condensatore in due porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza.
6 La porzione di luce che attraversa il campione cambia ulteriormente la fase e andandosi a ricombinare con la luce non rifratta renderà visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo. la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile a causa dell'elevata presenza di acqua le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare.
7 Come si preparano i campioni per l esame a fresco Il campione va mantenuto in un mezzo omogeneo che non ne alteri la trama strutturale A questo scopo si aggiungono soluzioni indifferenti, isotoniche rispetto al contenuto cellulare
8 Soluzioni indifferenti Liquidi naturali: succo dei tessuti, umor acqueo, liquido amniotico, albume dell uovo filtrato, siero di sangue Soluzioni saline indifferenti Soluzione fisiologica NaCl 0,9 % in H2O distillata (Per vertebrati omeotermi: mammiferi, uomo, uccelli) Soluzione di Ringer Soluzione di Locke Soluzione di Tyrode
9 Soluzione di Ringer (ph 7-7,4) Si compone di: cloruro di sodio gr 0,9 cloruro di Potassio gr 0,042 bicarbonato di sodio gr 0,02 cloruro di calcio secco gr 0,025 acqua distillata ml 100. Si scioglie a freddo. Il cloruro di calcio si aggiunge per ultimo. Di regola la soluzione va preparata al momento dell uso. Questa formula serve per gli animali omeotermi: per gli Urodeli si usano gr 0,8 e per gli Anuri gr 0,64 di cloruro di sodio.
10 Soluzione di Locke (ph 7-7,8) Si compone di: cloruro di sodio 0,85 gr cloruro di potassio 0,042 gr cloruro di calcio 0,024 gr bicarbonato di sodio 0,02 gr acqua distillata 100 ml. Si disciolgono i diversi ingredienti a freddo, aggiungendo per ultimo il cloruro di calcio.
11 Soluzione di Tyrode (ph 7,5-7,8) Si compone di: cloruro di sodio 0,8 gr cloruro di potassio 0,02 gr cloruro di calcio 0,02 gr cloruro di magnesio 0,01 gr fosfato monosodico 0,005 gr; bicarbonato di sodio 0,1 gr; glucoso (destroso) 0,1 gr; acqua distillata 100 ml. Per aumentare la viscosità di questi liquidi si aggiunge una sostanza macromolecolare inerte, come il polivinilpirrolidone, nella proporzione di 6 gr ogni 100 ml di liquido.
12 Tecniche d esame Vetrino portaoggetto + coprioggetto con eventuale lutaggio Vetrini portaoggetto: standard 76x26 mm Vetrini coprioggetto: standard 18x18 Spessore 0,14-0,17mm In camera umida Vetrini a goccia pendente
13 Colorazioni vitali Le colorazioni vitali entrarono in uso per i seguenti usi Evidenziare cellule con attività granulopessiche Evidenziare strutture del citoplasma cellulare come mitocondri e vacuoli Per colorare in toto embrioni in via di sviluppo Per mettere in evidenza proprietà delle membrane biologiche (permeabilità, assorbimento, trasporto) Un colorante vitale può essere utilizzato nell organismo vivente o su cellule o tessuti prelevati dal vivente ed ancora dotati di funzioni vitali
14 Coloranti vitali Acidi: Alizarina, blu tripano, blu pirrolo, rosso congo, inchiostro di china, litiocarminio, carminato di ammonio Basici: Blu di metilene, blu di toluidina, azzurro di metilene, solfato di blu di Nilo, bruno di BismarK, blu di cresile brillante, verde Janus Indifferenti rosso neutro
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