LA REPLICAZIONE DEL DNA

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1 LA REPLICAZIONE DEL DNA

2 Il modello a doppia elica di Crick e Watson suggerisce un meccanismo di replicazione

3 Meccanismi di replicazione Eliche parentali Molecole figlie Conservativo Dispersivo Semiconservativo

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6 Esperimento di Meselson e Stahl

7 La replicazione implica l attività di molti enzimi ed è un processo finemente regolato e coordinato con il ciclo cellulare

8 LA CHIMICA DELLA SINTESI DEL DNA Substrati necessari per la sintesi 2 deossinucleosidi trifosfati giunzione innesco:stampo

9 Sintesi del DNA al terminale 3 del primer Schema del meccanismo di sintesi: inizia con un attacco nucleofilo del fosfato α del dntp sul 3 OH del primer. La reazione determina l allungamento di un nucleotide al terminale 3 dell innesco ed il rilascio di una molecola di pirofosfato.

10 L idrolisi del PP è il motore per la sintesi XTP + (XMP) n (XMP) n+1 + PP ΔG = Kcal/mole pirofosfatasi PP 2 P i XTP + (XMP) n (XMP) n+1 + 2P i ΔG = - 7 Kcal/mole K eq = 10 5 la sintesi del DNA è una reazione irreversibile

11 Meccanismo d azione della DNA polimerasi drastica riduzione della velocità di reazione di volte - Flessibilità catalitica: unico sito attivo per l aggiunta dei quattro dntp - Selettività cinetica: controlla la capacità del nucleotide entrante di formare un corretto appaiamento con il nucleotide stampo (formazione di una struttura ottimale per la polimerizzazione)

12 Distinzione tra rntp e dntp a) Legame di un appropriato dntp alla DNA polimerasi: il 3 OH dell innesco e il fosfato α del dntp sono vicini. b) Il nucleotide ribo con il 2 OH crea un impedimento sterico nei confronti degli aa discriminatori del sito catalitico con conseguente allineamento scorretto del nucleotide entrante e abbassamento della velocità di reazione.

13 Studi sulla struttura atomica di diverse DNA polimerasi mostrano che il DNA si accomoda in una fenditura che somiglia al palmo della mano. Struttura tridimensionale della DNA polimerasi

14 Durante la polimerizzazione due ioni metallici si legano alla DNA polimerasi

15 Cambiamenti strutturali della DNA polimerasi

16 Cambiamenti strutturali della DNA polimerasi Il pollice non partecipa attivamente alla catalisi ma interagisce con il DNA di nuova sintesi Curvatura dello stampo di 90 C per permettere che soltanto la prima base dello stampo interagisca con il nucleotide entrante.

17 Caratteristiche delle DNA polimerasi Sintesi del DNA in maniera processiva Aumento della processività: interazione tra polimerasi e il DNA, intervento delle sliding clamp Attività esonucleasica e correttore di bozze

18 La forca replicativa Leading strand Lagging strand Frammenti di Okazaki: 1000/2000 nt nei batteri 100/400 nt negli eucarioti L inizio della replicazione richiede un primer a RNA (5-10 nt). L RNA polimerasi, detta la primasi, riconosce sequenze specifiche di ssdna (GTA in E.Coli) per legarsi sul filamento stampo.

19 Rimozione dei primer a RNA dal DNA neosintetizzato RNasiH = RNA:DNA hybrid: enzima che riconosce filamenti ibridi e degrada solo i legami tra ribonucleotidi ma lascia l ultimo ribonucleotide, legato all inizio del DNA,che verrà eliminato da una successiva 5 esonucleasi.

20 DNA elicasi Proteine esameriche (processive) con struttura ad anello che separano i due filamenti di DNA a livello della forca replicativa ed hanno diversa polarità in base al tipo di filamento a cui si legano ssdna-binding proteins (SSB) Le SSB sono proteine che stabilizzano e linearizzano il ssdna prodotto dal passaggio dell elicasi. Il legame tra SSB/SSB è un legame cooperativo. Le interazioni tra proteine e DNA è di tipo elettrostatico.

21 L attività della topoisomerasi a livello della forca replicativa Superavvolgimenti positivi con conseguente accumulo di tensioni torsionali. Tali superavvolgimenti devono essere eliminati per evitare il blocco del cammino della forca replicativa Le topoisomerasi tagliano uno o entrambi i filamenti di DNA superavvolto senza mai distaccarsi dal substrato e rilassando la struttura a valle della forca.

22 La specializzazione delle DNA polimerasi Nella cellula esistono diverse DNA polimerasi E. coli : 5 diverse polimerasi -DNA Pol III enzima coinvolto nella replicazione e associato ad altre proteine formando un complesso detto DNA Pol III oloenzima -DNA Pol I attività esonucleasica per rimozione dei primer e sintesi di DNA per riempire l interruzione Cellula eucariotica: 15 diverse polimerasi -DNA Pol δ: sintesi del filamento discontinuo -DNA Pol ε: sintesi del filamento guida -DNA Pol α/primasi : sintesi dell innesco

23 Struttura di una proteina di scorrimento (sliding clamp) Come può la processività della DNA polimerasi aumentare alla forca replicativa? Struttura a ciambella, nel foro centrale si accomoda il doppio filamento di DNA e 1-2 strati di acqua. Le sliding clamp oltre a legare il DNA si associano saldamente anche alla polimerasi facilitando lo scorrimento sul DNA stampo.

24 Le proteine sliding clamp aumentano la processività della DNA polimerasi Le DNA polimerasi non legate alla sliding clamp tendono a sganciarsi dalla giunzione innesco-stampo e a diffondere. Al contrario quando la sliding clamp è presente rafforza il legame tra polimerasi e DNA e ne aumenta la processività. Al termine della replicazione avvengono dei cambiamenti conformazionali tra le due proteine che ne diminuiscono l affinità. Le sliding clamp hanno forma ad anello in soluzione ma devono essere aperte per avvolgere il DNA. Caricatore delle sliding clamp: complesso proteico che apre e posiziona le sliding clamp sul DNA grazie all idrolisi dell ATP. Una volta posizionata la sliding clamp sul DNA il caricatore si allonatana per permettere l interazione con la DNA polimerasi nello stesso sito di legame.

25 La composizione dell oloenzima della DNA Pol III in E. coli La struttura dell oloenzima permette alle due DNA polimerasi di muoversi in maniera indipendente sui due filamenti (guida e discontinuo) permettendo così una replicazione simultanea in entrambe le direzioni e abbreviando i tempi di permanenza del DNA single strand.

26 Modello a trombone per coordinare le due DNA polimerasi in E. coli L elicasi si muove in direzione 5-3. L oloenzima interagisce con l elicasi grazie al fattore τ che lega entrambe le polimerasi. Un core della DNA pol III sintetizza il filamento guida e l altro il filamento in ritardo. Le SSB coprono il ssdna Periodicamente la DNA primasi si associa all elicasi per formare il primer sul filamento discontinuo Quando la polimerasi sul filamento discontinuo completa un frammento di Okazaki viene rilasciata dalla sliding clamp e dal DNA.

27 Il filamento discontinuo che ha acquisito un innesco diventa il bersaglio dell attività del caricatore della sliding clamp che riconosce una nuova giunzione innesco stampo. La giunzione innesco-stampo con la sliding clamp associata richiamano la DNA polimerasi che riparte con la sintesi del frammento di Okazaki successivo. Il complesso di tutte le proteine che lavorano alla forca replicativa viene chiamato replisoma. Le interazioni fra proteine del replisoma sono finemente regolate e facilitano la progressione della replicazione.

28 Il modello del replicone -Fase iniziale: unwinding del DNA ed inizio della replicazione in una o più zone interne -I siti dove il DNA si apre ed inizia le replicazione si chiamano ORIGINI DI REPLICAZIONE Iniziatore: unica proteina sequenza-specifica coinvolta nella replicazione Nel 1963 Jacob, Brenner e Cuzin proposero un modello per spiegare gli eventi che controllano l inizio della replicazione batterica. Replicone: tutto il DNA sintetizzato a partire da un unica origine. Il modello del replicone contempla due componenti che controllano l inizio della replicazione: -Replicatore: intera serie di sequenze nucleotidiche agenti in cis sufficienti per dirigere l inizio della replicazione. -Iniziatore: proteina (ATP dipendente) che riconosce in modo specifico un elemento del DNA che si trova nel replicatore e che attiva l inizio della replicazione.

29 Struttura del replicatore Iniziatore:DnaA Iniziatore:Antigene T Iniziatore:ORC Funzione della proteina iniziatore E. coli: DnaA (ATP dipendente) lega le sequenze di 9bp e apre il DNA a livello degli elemento di 13bp poi recluta altre proteine come l elicasi Cellule eucatiotiche: ORC complesso multiproteico che che lega l elemento A e B1. L idrolisi dell ATP serve a caricare l elicasi sul replicatore.

30 Modello per l inizio della replicazione in E. coli Eventi che si susseguono all interazione dell iniziatore sul replicatore. Formazione di due forche replicative e di due replisomi.

31 Replicazione negli eucarioti: processo che richiede due eventi in diversi momenti del ciclo cellulare Sul cromosoma degli eucarioti esistono diverse origini di replicazione che devono essere coordinate e regolate affinchè il cromosoma venga replicato una volta soltanto. 1) Selezione del replicatore in fase G1: processo che porta all assemblaggio di un complesso multiproteico 2) Apertura dei filamenti e reclutamento della DNA polimerasi avviene solo quando la cellula entra in fase S

32 Replicazione negli eucarioti: formazione del complesso pre-replicativo La selezione del replicatore è mediata dalla formazione di complessi pre-replicativi (pre-rcs) formati da quattro proteine separate che si assemblano in modo ordinato sul replicatore. Riconoscimento del replicatore da parte di ORC (iniziatore). ORC legato recluta due caricatori delle elicasi Cdc6 e Cdt1. Il complesso tra ORC e i due caricatori reclutano Mcm2-7 (elicasi eucariotica) Formazione del complesso pre-rc ancora inattivo in fase G1.

33 Attivazione del pre-rc in fase S e assemblaggio della forca replicativa L attivazione del pre-rc avviene tramite attività delle chinasi ciclina dipendenti : Cdk e Ddk che fosforilano i caricatori Cdc6 e Cdt1 promuovendo il distacco e la proteolisi. La fosforilazione avviane anche su altre proteine della forca come Mcm2-7 (elicasi) e si ha così il reclutamento delle DNA polimerasi nel seguente ordine: DNA polδ, DNA polε, DNA polα/primasi. Reclutamento della sliding clamp + caricatore (PCNA + RF-C) Distacco della primasi ed inizio della replicazione da parte della polimerasi δ sul filamento discontinuo e polimerasi ε su quello guida. Forche di replicazione attive contemporaneamente.

34 Regolazione e attività della Cdk Affinchè il cromosoma degli eucarioti venga replicato una volta soltanto la cellula mette in atto dei sistemi di regolazione il cui ruolo principale viene svolto dalla chinasi ciclina dipendenti. Fase G1 del ciclo cellulare Fase S del ciclo cellulare

35 Attività di CdK e formazione del pre-rc durante il ciclo cellulare

36 La topoisomerasi II catalizza la decatenazione dei prodotti della replicazione Il completamento della replicazione avviene con una serie di eventi e ciò dipende se il cromosoma è circolare (batteri) o lineare (eucarioti)

37 Cromosomi lineari e il problema della terminazione della replicazione

38 I telomeri Il telomero è la regione terminale di un cromosoma composta di DNA altamente ripetuto che protegge l'estremità del cromosoma stesso dal deterioramento o dalla fusione con cromosomi confinanti. Nei vertebrati la sequenza di nucleotidi nei telomeri è TTAGGG. Questa sequenza TTAGGG si ripete circa 2,500 volte negli umani ed al 3 di ogni cromosoma si estende con un tratto a singolo filamento che serve per richiamare sul sito la telomerasi. La telomerasi: enzima formato da diverse subunità proteiche e da un RNA (complesso ribonucleoproteico). Come le altre polimerasi agisce allungando l estremità 3 del suo substrato sfruttando uno stampo endogeno che è il suo filamento di RNA (trascrittasi inversa).

39 Replicazione dei telomeri tramite telomerasi La componente ad RNA si chiama TER (150 / 1300 basi) La subunità della telomerasi che svolge il ruolo di trascrittasi inversa si chiama TERT ed appartiene ad una classe di DNA polimerasi.

40 La telomerasi agisce allungando l estremità 3 del telomero ma così facendo permette la replicazione del DNA anche sul filamento complementare (discontinuo) attraverso la sintesi di frammenti di Okazaki e mantenendo la lunghezza del cromosoma. Tuttavia l estremità 3 del telomero sarà sempre una estremità protrudente

41 Proteine che legano il telomero e che influenzano l attività telomerasica S. cerevisiae uomo

42 Regolazione della lunghezza telomerica

43 Formazione del t-loop Le proteine legate a livello del telomero oltre ad inibre e regolare l attività della telomerasi svolgono anche un ruolo protettivo dell estremità 3 a singolo filamento per evitare che venga riconosciuta come una rottura al DNA che diventa bersaglio dell apparato di riparazione. Struttura t-loop I telomeri isolati da cellule umane formano un ansa data dall estremità 3 a singolo filamento che invade il tratto a doppio filamento del telomero stesso.

44 -Intenti degli autori -accenno delle metodiche utilizzate -Accenno dei risultati ottenuti -Breve conclusione

45 Attivazione del pre-rc in fase S e assemblaggio della forca replicativa L attivazione del pre-rc avviene tramite attività delle chinasi ciclina dipendenti : Cdk e Ddk che fosforilano i caricatori Cdc6 e Cdt1 promuovendo il distacco e la proteolisi. La fosforilazione avviane anche su altre proteine della forca come Mcm2-7 (elicasi) e si ha così il reclutamento delle DNA polimerasi nel seguente ordine: DNA polδ, DNA polε, DNA polα/primasi. Reclutamento della sliding clamp + caricatore (PCNA + RF-C) Distacco della primasi ed inizio della replicazione da parte della polimerasi δ sul filamento discontinuo e polimerasi ε su quello guida. Forche di replicazione attive contemporaneamente.

46 PCNA: proliferating cell nuclear antigen Struttura proteica della PCNA umana, tale struttura delimita un manicotto proteico in grado di scorrere sul DNA, PCNA si inserice anche nel complesso di replicazione del DNA e serve come un fattore di processività della DNA polimerasi. Tale struttura si compone a seguito dell'assemblamento di un trimero proteico.

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48 INTRODUZIONE DEL LAVORO PCNA fattore stimolante la processività della DNA polimerasiδ ed è una proteina sliding clamp che gioca un ruolo fondamentale nell assemblaggio della forca replicativa nei mammiferi. Il modello di reclutamento di PCNA sul DNA prevede prima il legame di RFC (fattore di 5 subunità che carica PCNA sull estremità 3 del primer) formando successivamente un complesso RFC/PCNA che legano la polδ e tale complesso proteico è ulteriormente stimolato dal legame con proteine SSB dette RPA Sulla forca replicativa lavorano contemporaneamente diversi fattori proteici come DNA elicasi, topoisomerasi e numerose proteine regolative come le cicline (famiglia A, B, G1, E, D) e Cdk cicline dipendenti che fosforilano sia PCNA che RPA modificandone la struttura e l attività. Sia polδ che PCNA partecipano a processi di replicazione che di riparazione del DNA in funzione del loro stato di fosforilazione e quindi capire quali sono le proteine con cui PCNA ha un rapporto diretto diventa di fondamentale importanza per capire i meccanismi molecolari alla base della replicazione e riparazione.

49 Scopo del lavoro e metodi di analisi: 1) Estrazione di proteine da tessuto di timo di vitello 2) L estratto proteico grezzo viene separato tramite cromatografia per affinità su colonne il cui ligando specifico è PCNA. Durante l eluizione vengono raccolte ed analizzate solo le frazioni che mostrano attività della DNA polimerasi 3) Prima analisi delle proteine nelle frazioni di interesse viene eseguita tramite SDS-PAGE 4) Le stesse frazioni (30 33) vengono ulteriormente analizzate tramite western blot con specifici anticorpi. Gli anticorpi usati sono diretti contro proteine della replicazione e della riparazione del DNA.

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51 Immunoblotting Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot

52 Purificazione delle proteine: La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà. Una proteina, per poter essere purificata, deve dapprima essere estratta dalla sua matrice biologica e poi allontanata selettivamente dalle altre proteine.

53 La procedura adottata per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

54 La rottura delle cellule può essere ottenuta mediante: Digestione enzimatica della parete o della membrana plasmatica mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi e proteasi (tripsina, collagenasi, ialuronidasi); Shock osmotico; Successivi cicli di congelamento/scongelamento; Generalmente devono però essere applicati metodi più energici, che sottopongono le cellule a stress meccanici. I metodi di rottura meccanici sono fondamentalmente di due tipi: mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido; mediante forze frizionali in sospensione di cellule.

55 In questo specifico lavoro le procedure utilizzate per ottenere un estratto proteico grezzo sono estremamente semplici e richiedono: - la rottura delle cellule in uno specifico buffer; - la centrifugazione del campione per rimuovere i residui insolubili.

56 Estrazione di proteine da tessuto Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) ph Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio) Proteasi Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

57 L estrazione proteica da tessuto di timo di vitello

58 Elettroforesi La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico (E) e alla carica della molecola (q) ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali fo resistenza): v = Eq/f dove f=6πrη

59 Fattori che influenzano la velocità di migrazione CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma) TAMPONE (Concentrazione, ph) SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

60 SUPPORTI Non setaccianti (Carta), acetato di cellulosa Setaccianti Gel di poliacrilammide(pag) Gel di Agarosio

61 Elettroforesi su gel Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica

62 Elettroforesi di Proteine Piu complessa dell elettroforesi di DNA Proteine diverse hanno cariche diverse Le proteine variano molto per forma Generalmente il gel e fatto di poliacrilammide

63 Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da 1 kilobase di DNA = 650 kda 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kda

64 Elettroforesi di proteine Condizioni Non Denaturanti Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell elettroforesi Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2 e 3 ; legami disolfuro covalenti) Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma Nome Carica Massa Forma Proteina Q +3 30kD Proteina R 4 42kD

65 Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell elettroforesi (SDS-PAGE) Le molecole di SDS si legano alle proteine Le proteine perdono la loro normale forma Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni Carica Massa +3 30kD SDS Carica Massa kD 4 42kD kD

66 Cosa e un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

67 Come funziona: Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica Includere un marker di peso molecolare colorato 10-50ug di estratto proteico totale 0.1-1ug di proteina purificata Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) Stacking ph 6,8 Il Gel Si muovono verso il gel separatore ( resolving ) Differenze di ph causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore Resolving ph 8,8 +

68 A cosa serve il Western Blot? Qual e la proteina che mi interessa? SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo? +

69 Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Stacking ph 6,8 Resolving ph 8,8 +

70 Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) membrana Terza fase: saturazione o blocking. (La saturazione e usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l anticorpo e la membrana) Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA)

71 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento Trasferimento dal catodo (-) all anodo (+) 1) Spugnette 2) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 3) Gel 4) Membrana 5) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 6) Spugnette

72 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario Quarta fase: legame dell anticorpo primario. (L anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana)

73 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario Quinta fase: legame dell anticorpo secondario. (L anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l anticorpo primario, gia legato alla proteina sulla membrana)

74 Western blot: sesta fase rivelazione o detection Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substrati Chemioluminescenti Emettono luce se convertiti dall enzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Marcatura radioattiva Anticorpi secondari biotinilati

75 Western blot substrato HRP HRP luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina

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77 FASE STAZIONARIA: matrice FASE MOBILE: analita ed eluente cromatogramma La cromatografia consiste nella separazione di molecole in una soluzione liquida o gassosa (fase mobile) attraverso l interazione con una componente solida (fase stazionaria): a seconda di come le molecole, che possiamo chiamare anche analiti, interagiscono con la fase stazionaria esse risulteranno ritardate nel loro movimento, permettendone quindi la separazione, o risoluzione. La fase mobile comprende anche le sostanze utilizzate per trascinare il campione da analizzare sulla fase stazionaria, chiamate eluenti. Il movimento degli analiti sarà anche influenzato dall interazione con l eluente.

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80 FASE STAZIONARIA: matrice FASE MOBILE: analita ed eluente Generalmente usata per separare miscele di analiti ad alte concentrazioni La tecnica più usata per separare miscele di analiti dalle elevate concentrazioni o che necessitano di un elevato grado di purificazione è la cromatografia su colonna, per le quali viene usata una particolare fase stazionaria, chiamata matrice, che permette di separare in maniera specifica molecole con certe caratteristiche e che viene costruita, o meglio impaccata, all interno di un tubo di vetro, chiamato appunto colonna cromatografica. La matrice viene equilibrata, in modo che non ci siano crepe o molecole estranee al suo interno, prima di caricare il campione da analizzare. In seguito viene fatto un lavaggio, al fine di eliminare tutti gli analiti che non interagiscono con la colonna, o lo fanno solo debolmente, che spesso sono indesiderati. L eluizione permette di separare singolarmente le varie molecole secondo i criteri scelti precedentemente dall operatore, fino a quando tutto, o ciò che ci interessa,è stato raccolto. Gli analiti e l eluente si muoveranno verso il basso, sfruttando la forza di gravità. Per velocizzare le operazioni si utilizzano alte pressioni, come nella tecnica chiamata HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione).

81 A seconda del tipo di matrice utilizzata distingiuamo 3 tipi principali di cromatografia su colonna. Cormatografia per gel filtrazione Cromatografia a scambio Ionico Comatografia per affinità Resta ora il problema di come è possibile verificare visivamente l avvenuta separazione dei vari analiti: nel caso in cui le molecole in questione siano caratterizzate da uno spiccato colore, come i pigmenti presenti nei vegetali, è facile raccogliere in beute le sostanze sostanze di diverse espressioni cromatiche. Spesso però le molecole che ci interessa purificare sono invisibili all occhio umano, poichè in grado di assorbire la luce a lunghezze d onda esterne a quelle dello spettro visibile. Per questo motivo si utilizza un lettore di assorbanza (spesso nell ultravioletto) in grado di emettere un segnale ogni qual volta una molecola esce dalla colonna cromatografica, permettendo di stimare per esempio la sua concentrazione.

82 Gel filtrazione (o esclusione molecolare): la matrice è simile a una spugna che permette, grazie ai suoi pori, di escludere le molecole più grandi, e di intrappolare le più piccole, ritardandole nella discesa.

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84 Cromatografia a scambio ionico: cariche negative poste sulla matrice sono in grado di attrarre e trattenere solo molecole con carica opposta (cationi), e viceversa.

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87 Cromatografia per affinità: la fase stazionaria presenta molecole altamente affini o specifiche per il determinato analita che vogliamo purificare.

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91 PCNA column e BSA column Matrice : CH sepharose 4B Ligando: PCNA ricombinante overesperessa in E. coli o BSA (albumina sierica) Lavaggio della colonna con KCl 50 mm e TGEED buffer Eluizione con KCl 0.5 M e TGEED buffer

92 Attività della DNA polimerasi δ Estratto proteico di timo viene separato sulla colonna Le frazioni eluite vengono saggiate per l attività della DNA pol δ (H 3 -dnmp incorporati sul un templato) Usando una fase mobile di 0.5M KCl l attività massima della polimerasi si registra nella frazione numero 33

93 Profilo SDS-PAGE di proteine legate alla colonna-pcna e alla colonna-bsa Estratto proteico presente nella frazione viene saggiato per la presenza di proteine di diverso peso molecolare che interagiscono con polδ e con PCNA tramite SDS-PAGE (metodo di separazione grossolano) La colorazione del gel permette di verificare la presenza di numerose proteine che presumibilmente interagiscono direttamente con PCNA. Ma quali sono tali proteine? Il Marker (S) indica solo i pesi molecolari.

94 Western blot permette di identificare le proteine che interagiscono con PCNA e che sono coinvolte nella replicazione

95 Western blot di proteine coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare

96 DISCUSSIONI E CONCLUSIONI La cromatografia per affinità rappresenta un metodo molto accurato e selettivo per identificare l interazione tra proteine. L interazione con diverse proteine identificato con la cromatografia e dimostrato ulteriormente con il western blot suggerisce che PCNA è una proteina chiave per la formazione di complessi multiproteici coinvolti non soltanto nella replicazione ma anche nella regolazione del ciclo cellulare e nei meccanismi di riparo.