Relazione Preliminare Sclerosi Multipla 24/11/2014

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1 Relazione Preliminare Sclerosi Multipla 24/11/2014 Da tempo è noto che le specie reattive dell ossigeno (ROS) e dell azoto (RNS) possono avere un doppio significato nella fisiopatologia umana: maligno o benigno. La sovrapproduzione di ROS/RNS causa stress ossidativo, o nitrosativo, al quale consegue l alterazione delle strutture cellulari, incluse le membrane, i lipidi, le proteine e il DNA. In contrapposizione, a basse concentrazioni di ROS/RNS corrisponde un ruolo fisiologico nella regolazione delle risposte cellulari, innanzitutto attraverso una modulazione delle vie di trasduzione del segnale. Inoltre non è risolta la questione se la formazione di ROS/RNS sia sempre una causa primaria o, a volte, solo una conseguenza del danno tissutale. Il sistema nervoso centrale è particolarmente vulnerabile nei confronti dei processi ossidativi a causa delle elevate quantità di ossigeno richieste dal metabolismo neuronale, dell elevato contenuto di acidi grassi insaturi, facilmente aggredibili dalla perossidazione, nei fosfolipidi delle membrane cellulari e mieliniche, e della presenza, specie in alcune regioni dell encefalo, di depositi significativi di metalli redox-attivi come il ferro o il rame. Nel morbo di Alzheimer, l accumulo nell encefalo di beta-amiloide si accompagna a gradi significativi di danno ossidativo. E stato riportato recentemente che le forme oligomeriche di betaamiloide (piuttosto che quelle fibrillari) hanno la capacità di stimolare la formazione di acqua ossigenata e promuovere la perossidazione lipidica. Il fenomeno sembra legato al fatto che gli aggregati di amiloide hanno la capacità di legare e ridurre i metalli di transizione, ferro, rame ed anche zinco. I processi di ossido-riduzione così innescati portano appunto alla formazione di ROS, tra le quali il radicale ossidrile è particolarmente attivo nell iniziazione di perossidazione dei lipidi. Nei cervelli colpiti si possono dunque evidenziare numerosi biomarcatori di stress ossidativo: aumentati livelli di malonaldeide, 4-idrossi-nonenale, proteine ossidate, DNA ossidato; diminuiti livelli di acidi grassi insaturi; formazione di perossinitrito e presenza di proteine da esso nitrosate nelle cellule microgliali che circondano le placche fibrose. Analoghi fenomeni di ossido-riduzione, sembrano partecipare alla patogenesi del

2 danno che colpisce, nel morbo di Parkinson, i neuroni dopaminergici nella substantia nigra del mesencefalo, una regione in effetti particolarmente ricca di ferro. Peraltro, complesse e non ancora comprese interazioni coinvolgono nei processi degenerativi anche il glutatione, il NO e la dopamina, dotata essa stessa della capacità di catalizzare reazioni di ossido-riduzione del ferro e del rame.. Un discorso a parte deve essere invece dedicato alla Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA). L osservazione che nelle forme familiari della malattia vengono ereditate mutazioni a carico del gene della superossido dismutasi rame-zinco denominata SOD1, che detossifica l anione superossido trasformandolo in acqua, indusse i ricercatori a ritenere che nella patogenesi della malattia fosse cruciale la perdita di funzione antiossidante di questo enzima. Gli studi successivi hanno però dimostrato che la proteina enzimatica mutata forma aggregati citotossici, e che la perdita di attività enzimatica non è coinvolta. Ma troppi sono ancora gli aspetti misteriosi di questa patologia che ancora attendono di essere svelati. Gli F2-isoprostani sono dei markers che individuano lo stress ossidativo. Fanno parte della famiglia degli eicosanoidi, ormoni locali derivanti dal metabolismo degli acidi grassi poliinsaturi della famiglia Omega-3 e Omega-6. Gli F2-isoprostani vengono prodotti dall ossidazione radicalica dei fosfolipidi circolanti e presenti nelle membrane cellulari. Poiché la produzione di un eicosanoide influisce sull azione e sulla produzione di quasi tutti gli altri ormoni, gli F2-isoprostani hanno funzioni essenziali per la regolazione delle attività e delle funzioni cellulari. In presenza di patologie neurologiche come la sclerosi multipla, essi risultano concentrati nel plasma e nel liquido cerebrospinale in quantità maggiori. Soprattutto nella SM recidivante remittente, i livelli rilevati aumentano man mano che la patologia avanza. Anche se ancora non è stato chiarito come viene provocato nella sclerosi multipla (SM) il danno neuro-assonale, è ormai assodato il ruolo sostanziale dei meccanismi ossidativi.

3 Sclerosi Multipla (SM) e Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) La SM è una malattia che colpisce la sostanza bianca del sistema nervoso centrale, cervello e midollo spinale. Si chiama: Sclerosi, perché si formano delle cicatrici nelle zone danneggiate; Multipla, perché il processo colpisce il SNC in parti diverse e in tempi successivi. Viene anche chiamata Malattia Demielinizzante, Sclerosi a Placche,o Nevrassite. Le lesioni infiammatorie demielinizzanti, sono localizzate a livello delle guaine mieliniche che come dei manicotti rivestono i nervi. La mielina oltre ad un ruolo protettivo permette all impulso nervoso di viaggiare velocemente lungo il nervo, garantendo quindi una perfetta conduzione dello stimolo nervoso. In questa malattia la perdita di mielina (demielinizzazione) porta ad un rallentamento dell impulso nervoso e quindi alla comparsa di numerosi sintomi neurologici. La SLA è una grave malattia degenerativa che colpisce i motoneuroni le cellule nervose del cervello e del midollo spinale che controllano il movimento muscolare. Si chiama Sclerosi, perché si formano delle zone di indurimento, cicatrizzazione; Laterale, perché le lesioni sono localizzate nei fasci che decorrono nei cordoni laterali del midollo spinale; Amiotrofica, perché le lesioni provocano un assottigliamento, un dimagrimento dei muscoli. Viene anche chiamata Malattia di Charcot, Malattia di Lou Gehrig o malattia dei Motoneuroni. Esistono due gruppi di motoneuroni: il I motoneurone ( motoneurone centrale o corticale) si trova nella corteccia cerebrale e trasporta il segnale dal cervello al midollo spinale, il II motoneurone (motoneurone periferico o spinale) si trova nel midollo spinale e trasporta il segnale in periferia ai muscoli. Nella SLA sono colpiti sia il I che il II motoneurone. Man mano che i motoneuroni muoiono si assiste ad una lenta e progressiva perdita di forza muscolare che può portare fino alla paralisi. Più motoneuroni muoiono più il muscolo innervato diventa debole e sottile. Protocollo sperimentale 1. Induzione dell encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in topi C57BL6.

4 il modello animale di SM, l encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), è indotto dall immunizzazione con antigeni della mielina, che provoca l attivazione di linfociti T encefalitogenici che entrano nel SNC, attaccano le cellule che formano la mielina (gli oligodendrociti) e danno inizio ad una reazione infiammatoria amplificata dalle cellule residenti nel SNC, come gli astrociti e la microglia. I sintomi clinici neurologici della EAE sono stati determinati seguendo le linee guida del IACUC (The University of Pennsylvania s Institutional Animal Care and Use Committee) : EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE ENCEPHALOMYELITIS & OTHER DEMYELINATING RODENT DISEASE MODELS * Valori per segni clinici EAE (IACUC) *Vedi protocollo allegato

5 Descrizione segni clinici EAE (IACUC)

6 Dosaggi biologici 1. Valutazione dei livelli di F2-isoprostani nel plasma e liquido cefalorachidiano 2. Anticorpi anti oligodendrociti MAB 1580 clone RIP. Il marker MAB 150 clone RIP è stato utilizzato per valutare l induzione della patologia e il danno degli oligodendrociti del SNC. 3. Anti GALC (l espressione del gene GalCer è un marker del differenziamento degli oligodendrociti). Trattamento 50 topi del ceppo C57BL/6 sono stati trattati per l induzione della EAE. Tre gruppi di animali sono stati utilizzati per la sperimentazione. Ogni gruppo è stato allevato in gabbie separate e controllato giornalmente. Gruppo A: 10 animali di controllo con induzione della EAE trattati con saccarosio diluito in acqua al 50% 2 volte al giorno per 63 giorni Gruppo B: 20 animali con induzione di EAE trattati 2 volte al giorno per 63 giorni oralmente con Citozym diluito in acqua al 25% (1:4). Gruppo C: 20 animali trattati con induzione di EAE trattati 2 volte al giorno per 63 giorni oralmente con Citozym diluito in acqua al 50% (1:2 v/v) Osservazione segni clinici : gli animali venivano osservati giornalmente per il controllo dei segni clinici da EAE e classificati secondo le guide IACUC (vedi sopra). I dati sono riportati come osservazione su di un numero di animali superiore al 75%. Prelevo campioni biologici: Il prelievo di sangue è stato effettuato ogni 7 giorni dal padiglione auricolare dell animale. Da questo è stato preparato il plasma. Il liquido cefalorachidiano è stato raccolto ogni 15 giorni per puntura lombare. Le tre serie di campioni sono state analizzate per i livelli di F2-isoprostani e altri parametri come indicato nel protocollo sperimentale.

7 Risultati sperimentali Tabella I Segni neurologici : (vedi linee guida IACUC) Gruppo Giorno 0-7 : Giorno Giorno Giorno Giorno Giorno Giorno Giorno >5 4 3 Giorno * 5 3 *sacrificati E risultato evidente che il trattamento con Citozym alle più alte concentrazioni ha ridotto drasticamente i segni neurologici indotti dalla encefalo mielite autoimmune sperimentale (Tabella I e Figura 1). I topi di controllo dopo giorni hanno presentato chiari segni di quadriplegia. Dopo giorni hanno mostrato segni di difficoltà respiratoria e in accordo con le linee guida dell IACUC sono stati sacrificati I topi trattati con Citozym 1:4, hanno evidenziato paraplegia e incontinenza urinaria dopo trattamento di giorni, peggiorando e raggiungendo

8 lo stato di quadriplegia verso la conclusione del trattamento (56-63 giorni). I topi trattati con Citozym 1:2 hanno invece mantenuto la condizione di paraplegia e incontinenza urinaria senza peggiorare, fino alla conclusione dell esperimento. FIGURA 1 Inserendo in un grafico il punteggio ottenuto con la Tabella I secondo le linee IACUC, si evince la differenza della sintomatologia fra i tre gruppi (Figura 2). In particolare il gruppo 3 mostra evidenti segni di una rallentata sintomatologia rispetto al gruppo di controllo 1 e al gruppo 2. Il controllo della riemielinizzazione degli assoni da parte degli oligodendrociti è in corso di lavorazione (elaborazione con anticorpi anti oligodendrociti MAB 1580 clone RIP ed espressione del gene GalCer). La figura 3 evidenzia un risultato preliminare sulla demielinizzazione in seguito a degenerazione degli oligodendrociti. Sulla base dei dati preliminari, si presume che il trattamento con Citozym a più alta concentrazione possa favorire la formazione di nuove guaine mieliniche o rallentarne la degradazione. Tale risultato potrebbe esteso alla SM nell umano, considerando che si tratta di una patologia demielinizzante molto simile alla EAE.

9 FIGURA 2 FIGURA 3

10 Parametri biologici I livelli plasmatici e nel liquido rachidiano degli F2-isoprostani sono risultati ridotti in seguito al trattamento con Citozym alle due concentrazioni utilizzate. La cascata di reazioni che porta alla formazione degli F2-isoprostani, ma anche di altre specie chimiche, prende il nome di perossidazione lipidica e permette quindi di valutare il potere antiossidante di un integratore o di un farmaco. I livelli e la identificazione in vivo dei neuroprostani è stata effettuata mediante l utilizzo di tecniche GC/MS e LC/ESI/MS/MS. Quest ultima tecnica si è rivelata particolarmente importante per la caratterizzazione delle varie serie di neuroprostani e la loro quantificazione. Poiché i neuroprostani si trovano esterificati a fosfolipidi, il campione è stato idrolizzato con metodi chimici (KOH o fosfolipasi). La formazione dei neuroprostani, in analogia con quanto avviene per gli F2-isoprostani o per le prostaglandine, avviene per ossidazione di acidi grassi insaturi presenti nelle membrane cellulari. Gli F2- isoprostani della serie 2 e le prostaglandine derivano dall ossidazione dell acido arachidonico, gli F3-isoprostani della serie 3 da quella dell acido eicosapentenoico (EPA) mentre il precursore dei neuroprostani è l acido docosaesenoico (DHA). In questi ultimi anni la determinazione dei livelli di F2-isoprostani nei tessuti e nei liquidi biologici ha significativamente migliorato la nostra conoscenza sul ruolo svolto dallo stress ossidativo in molte patologie neurologiche. Un aumentato livelli di F2-isoprostani indica una forte perossidazione lipidica, al contrario la loro riduzione è segno di azione antiossidante. A tal fine sono stati valutati i livelli di queste molecole, per poter correlare la variazione dei segni neurologici conseguenti al trattamento con Citozym, nei gruppi 2 e 3, al potere antiossidante potenzialmente esercitato da questo integratore. Risulta evidente la riduzione dei livelli di F2-isoprostani sia nel plasma ch nel fluido cefalorachidiano degli animali trattati con Citozym alle due concentrazioni utilizzate ( Figura 4 e 5).

11 FIGURA FIGURA 5

12 Conclusioni La sclerosi multipla (SM o sclerosi a placche), è una delle più comuni malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale (encefalo e midollo spinale). E una patologia infiammatoria, demielinizzante, cronica e spesso progressivamente invalidante. Nella SM si pensa che una reazione autoimmunitaria anormale aggredisca e distrugga la mielina (demielinizzazione), provocando aree scoperte e cicatrizzate chiamate placche o lesioni lungo il nervo. Ciò significa che il sistema immunitario reagisce contro una componente dell organismo come se questa fosse estranea, aggredendola e distruggendola come farebbe con qualunque aggressore esterno. La conduzione degli impulsi nervosi viene di conseguenza rallentata o bloccata. Per tali motivi la encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un ottimo modello di SM. Le cause della SM non sono ancora note. Sulla base dei risultati di molte ricerche scientifiche si ritiene siano coinvolti più fattori che interagiscono tra loro: una predisposizione genetica e fattori ambientali in grado di stimolare il sistema immunitario. I fattori esterni, ambientali, sarebbero cruciali sia per quanto riguarda l induzione della malattia che per il suo mantenimento con lo scatenamento delle ricadute. Molti studi hanno evidenziato un associazione cronologica tra le ricadute e le infezioni respiratorie o urinarie. Anche le vaccinazioni possono precedere sia l insorgenza della malattia che lo scatenamento delle ricadute. Molti virus e alcuni batteri sono stati ripetutamente incriminati come responsabili della malattia, ma per nessuno di questi è mai stata fornita una prova definitiva. Probabilmente non è importante un unico agente specifico, ma potrebbe essere il processo stesso dell infezione specialmente quando questo avvenga in un certo momento temporale corrispondente ad una particolare situazione immunitaria del paziente. La SM è una malattia a diffusione mondiale. In Italia persone sono colpite da SM, uno ogni abitanti. Ogni anno si verificano nuovi casi. L età di esordio è tra i 15 e i 50 anni, anche se questa malattia si manifesta soprattutto tra i giovani adulti, tra i 20 e i 30 anni, e tra le donne, in un rapporto di 2 a 1 rispetto agli uomini.

13 I sintomi della SM sono molteplici. La loro varietà dipende dal fatto che le lesioni demielinizzanti (placche) tipiche della malattia possono colpire aree diverse del sistema nervoso centrale (encefalo, midollo spinale e nervo ottico). A seconda della sua localizzazione, una placca può causare per esempio un disturbo motorio a un arto inferiore, un problema di vista o un formicolio a mano e braccio. La maggior parte dei pazienti presentano un esordio brusco con successive ricadute e remissioni. Solo una minoranza presenta un rapido progressivo peggioramento clinico. Il deterioramento è in genere lento ed avviene con ricadute non seguite da un completo recupero funzionale; ecco come si fa strada la disabilità permanente. Il trattamento della SM prevede forme di intervento in relazione alla fase della malattia, al tipo di decorso e alla gravità del quadro clinico. Molta dell'attuale ricerca sulla SM è incentrata sul tentativo di chiarire l'esatta natura della risposta autoimmunitaria contro la mielina, al fine di contrastarla, e sul tentativo di trovare i fattori che permettano la rimielinizzazione dei nervi danneggiati. E' stato dimostrato che la rimielinizzazione avviene spontaneamente in alcune lesioni e studi sul modello animale di SM hanno dimostrato che alcuni composti farmacologici sono in grado di indurre la rimielinizzazione nei nervi demielinizzati. Recentemente è stata caratterizzata un altra classe di prodotti derivati dalla perossidazione lipidica, gli isoprostani, che presentano alcuni importanti vantaggi rispetto agli indicatori di stress ossidativo classicamente utilizzati. Tali vantaggi sono prevalentemente associati alla loro stabilità, relativa abbondanza e disponibilità di metodi analitici specifici e sensibili per la loro misurazione in tessuti e liquidi biologici. Il sistema nervoso centrale è particolarmente vulnerabile nei confronti dei processi ossidativi a causa delle elevate quantità di ossigeno richieste dal metabolismo neuronale, dell elevato contenuto di acidi grassi insaturi, facilmente aggredibili dalla perossidazione, nei fosfolipidi delle membrane cellulari e mieliniche., e della presenza, specie in alcune regioni dell encefalo, di depositi significativi di metalli redox-attivi come il ferro o il rame. I processi di ossido-riduzione così innescati

14 (redox cycling) portano appunto alla formazione di ROS, tra le quali il radicale ossidrile è particolarmente attivo nell iniziazione di perossidazione dei lipidi. Analoghi fenomeni di redox cycling sembrano partecipare alla patogenesi del danno che colpisce nella SM (Genaro G Ortiz et al. 2007). Peraltro, complesse e non ancora comprese interazioni coinvolgono, nei processi degenerativi anche il glutatione, il NO e la dopamina, dotata essa stessa della capacità di catalizzare reazioni di redox cycling del ferro e del rame. L utilizzo di una miscela di componenti ad alto potere antiossidante, in animali nei quali è stata indotta la EAE, ha permesso di controllare la potenziale utilità nel ridurre i sintomi neurologici, seguendo le linee guida internazionali IACUC e valutando un parametro biochimico che attualmente si è dimostrato utile nel quantificare l estensione del danno neurologico, gli isoprostani. I risultati della sperimentazione presentati in questa relazione evidenziano chiaramente un rallentamento, in animali affetti da EAE, dei danni neurologici in seguito alla somministrazione orale di Citozym (50% in acqua v/v) per due volte al giorno per 63 giorni totali. La valutazione dei livelli di isoprostani effettuata sia nel plasma che nel fluido cefalorachidiano, ha permesso di evidenziare la potente azione antiossidante del Citozym che ha condotto alla netta riduzione della concentrazione di queste molecole. In conclusione si può affermare che sono state poste le basi per una potenziale sperimentazione su pazienti affetti da SM con l intento di migliorare la qualità della vita di tali soggetti. Bibliografia: Genaro G Ortiz, Fermín P Pacheco-Moisés, Oscar K Bitzer-Quintero, Ana C Ramírez-Anguiano, Luis J Flores-Alvarado, Viridiana Ramírez-Ramírez, Miguel A Macias-Islas, Erandis D Torres-Sánchez Immunology and Oxidative Stress in Multiple Sclerosis. Clinical and Basic Approach. Neuroscience Letters 2007; 414(3): Roma 24/11/2014 Prof. Simone Beninati Dott. Francesco Antonelli