C. I. di Genetica e Biol. Mol. GENETICA

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1 C. I. di Genetica e Biol. Mol. GENETICA a.a Prof. Pier Franco Pignatti Lezioni N Malattie da mutazioni dinamiche (Neri-Genuardi cap. 15) Espansione di triplette, premutazioni, anticipazione

2 Le sequenze di DNA ripetuto sono spesso coinvolte in malattie Crossing-over diseguale Scambio diseguale fra cromatidi fratelli Conversione genica Duplicazione Delezione Inserzione Inversione Espansione di ripetizioni instabili

3 Espansione di ripetizioni instabili Es: FRAXA NEJM 332:1499, 1995

4 Instabilità delle ripetizioni In blu: interruzioni che rendono gli alleli stabili Mancano interruzioni e gli alleli si espandono: alleli instabili Es: SCA. Nota: una eccezione alla regola, una grossa espansione di un allele paterno interrotto in una grave forma di SCA-2 con esordio infantile ( Kobayshi H et al, 2011) Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana UTET 2000

5 Meccanismo di espansione CAG:Gln

6 Espansione massiva

7 Espansioni non codificanti SCA36 (GGCCTG) c9ftd/als (GGGGCC)

8 Espansioni codificanti glutamina

9 Malattie da mutazioni dinamiche DM2 XL AR AD AD >40 m. neurologiche, neurodegenerative, neuromuscolari Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999; JRGatchel & H Zoghbi 2005

10 1 SINDROME DELL X FRAGILE FXS

11 Disabilità intellettiva (XLID) sindromica 102 geni associati con XLID Lubs HA et al. 2012

12 SINDROME DELL X FRAGILE S. di Martin-Bell (1943). La forma più comune di disabilità intellettiva ereditaria. Una delle più frequenti cause note di disabilità intellettiva e autismo. Affetti 1:4.000 maschi, 1:6.000 femmine. Sito fragile Xq27.3 (FRAXA) in terreno privo di folato (Lubs 1969). Alterazione della replicazione del DNA

13 Espansione di FMR1 1991: identificazione del gene FMR1 e della prima mutazione dinamica (che si modifica nel passaggio da una generazione all altra) Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999

14 Il paradosso di Sherman Numeri in rosso: numero di CGG ripetute. T: trasmettitore sano. % : rischio di ritardo mentale. Espansione preferenziale nella linea femminile Paradosso di Sherman: aumento del numero di casi (penetranza) col passare delle generazioni Fu YH et al «Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox»

15 Funzione del gene FMR1 FMRP è una proteina che lega l RNA e regola la traduzione di un gruppo di mrna dei dendriti inibendo l attività di altri geni Topi con gene Fmr1 inattivato hanno perdita della proteina FMRP e alterata maturazione della trasmissione glutamatergica durante il periodo critico perinatale FMRP è necessaria per il normale procedere della maturazione sinaptica durante lo sviluppo. La sua assenza causa una eccessiva sintesi proteica nei dendriti postsinaptici e una alterazione della funzionalità sinaptica

16 Espansione di triplette gene FMR1 Santoro MR et al, Ann Rev Pathol Mech Dis 2012

17 PREMUTAZIONI FMR1 La premutazione ( CGG) causa aumento di trascritti e diminuzione di FMRP probabilmente a causa di un sequestro da parte dell espansione CGG di proteine che legano l mrna. Può dare : Sindrome con Tremore e Atassia associata a X fragile (FXTAS) Malattia neurodegenerativa a inizio tardivo. La penetranza nei maschi di più di 70 anni è >50%, mentre nelle donne è minore Insufficenza ovarica primaria associata a X fragile (FXPOI) in circa il 20% delle donne portatrici della premutazione. Menopausa precoce

18 FXS e premutazioni FMR1in FXTAS La sindrome dell X fragile è causata dal silenziamento epigenetico del gene FMR1 dovuto a grandi espansioni (>200 ripetizioni) di un elemento non codificante CGG. Espansioni più piccole chiamate premutazioni ( ripetizioni) possono causare un gruppo di fenotipi del neurosviluppo (malattia da deficit di attenzione e iperattività, disordine dello spettro autistico, malattia convulsiva) e neurodegenerative (sindrome con tremore e atassia associata all X-fragile, FXTAS) con un meccanismo completamente diverso caratterizzato da un aumento della produzione e della tossicità dell mrna di FMR1 Hagerman R e P Hagerman 2013

19 Modello della tossicità dell RNA nelle premutazioni FMR1 in FXTAS Una o più proteine legano l RNA in proporzione alla sua lunghezza. C è poco legame per il numero di ripetizioni normale. Un eccesso di legame o addirittura il sequestro di queste proteine determina una insufficenza funzionale delle proteine stesse e la diminuzione delle concentrazione della FMRP Hagerman R e P Hagerman 2013

20 2 ATASSIA DI FRIEDREICH FRDA

21 ATASSIA DI FRIEDREICH La sindrome atassica ereditaria più frequente nelle popolazioni caucasoidi (3-4: , AR) Insorgenza pubertà, perdita progressiva coordinazione muovimenti ed equilibrio Deficit di energia: anche cardiomiopatia ipertrofica che può condurre a morte precoce Gene FXN (frataxina) mappato cr. 9q13 Triplette GAA nel primo introne: da normale a espansioni causano silenziamento genico Espansioni meno grandi sono correlate con un esordio più tardivo

22 Frataxina Proteina mitocondriale che mantiene omeostasi Fe mitocondriale ed ha ruolo protettivo dal danno nucleare FRDA: perdita di funzione della proteina espansa. La funzione mitocondriale è alterata con sovraccarico di Fe, difetto produzione ATP, difetto funzionamento neuroni e cardiomiociti; instabilità cromosomica, aumento sensibilità mutageni chimici e specie reattive dell ossigeno (ROS) Tentativi terapeutici: rimozione Fe mitocondri mediante sostanze chelanti, contrasto allo stress ossidativo con antiossidanti, aumento dell espressione genica con eritropoietina e inibitori della deacetilasi istonica

23 Sperimentazione per aumentare l espressione genica di FXN con inibitori della deacetilasi istonica Possibile via di silenziamento nella atassia di Fridreich. Sono stati compleatati studi preclinici di sicurezza e tossicità di un composto ed è stato iniziato uno studio di fase I in pazienti FRDA Gottesfeld JM, JR Rushe, M Pandolfo 2013

24 3 POLIGLUTAMINOPATIE PoliQ

25 POLIGLUTAMINOPATIE Una famiglia comprendente 9 malattie neurodegenerative da espansione Il tratto poliglutaminico conferisce alle proteine un guadagno di funzione tossico che porta a inizio tardivo della malattia e perdita progressiva di neuroni in regioni specifiche del SNC Possibile contributo di modificazioni posttraduzionali della proteina

26 Alcune Poliglutaminopatie SBMA HD SCA DRPLA NEJM 340:1974, 1999

27 Test genetici brevettati per SCA Berthels N et al, EJHG 2011

28 MALATTIA DI HUNTINGTON (HD) George Huntington (1872) descrive la malattia AD caratterizzata da disabilità motoria progressiva e deterioramento mentale. Prevalenza 3-7: Read e Donnai, Genetica Clinica, Zanichelli 2007

29 La iniziale localizzazione del gene Parte di una grande famiglia venezuelana che ha permesso di localizzare il gene sul cromosoma 4 nel Analisi di linkage con RFLP e il marcatore G8, situato a 3cM dal gene HTT (IT15) Gusella et al Science 225:1320,1984

30 La identificazione del gene HTT N: triplette HD: triplette Gene IT15, poi chiamato HTT (Huntingtina) identificato nel Nel 1994 Uno studio mondiale della mutazione HD. La sensibilità e la specificità di misurare le ripetizioni CAG conclude che la lunghezza delle ripetizioni è un marcatore sensibile e specifico della ereditarietà della mutazione Kremer B et al, NEJM 1994

31 Amplificazione somatica del gene HTT 50 copie 20 copie S: DNA da sperma. L: DNA da linfociti. Si nota una particolare instabilità delle triplette ripetute nella meiosi maschile. Infatti si può avere insorgenza precoce della malattia trasmessa dal padre. L età di esordio è inversamente correlata alla lunghezza della espansione, anche nel tessuto cerebrale Nature Genet 387,1993

32 Possibile meccanismo patogenetico poliq Formazione di inclusioni nucleari neuronali di aggregati proteici non specifici tossici per i neuroni. Specificità: in HD una proteina striatospecifica lega poliq-htt; in SCA fattori trascrizionali Purkinje-specifici. La proteina espansa è tossica per i neuroni. La morte cellulare progressiva porta alla malattia a insorgenza tardiva.

33 4 DISTROFIA MIOTONICA DM

34 DISTROFIA MIOTONICA Amimia e aspetto scavato del volto, ptosi, iposviluppo muscolo mandibola e sternomastoideo DM o Malattia di Steinert (1909): ipotonia muscolare con miotonia (debolezza della contrazione muscolare e difficoltà rilassamento), deperimento, anomalie della conduzione cardiaca ecc. La più frequente fra le distrofie muscolari a ereditarietà autosomica (1:8.000). Gene DMPK: distrofia miotonica protein chinasi. Espansione (CTG)n al 3 UTR

35 Numero di triplette DMPK ed età esordio Triplette nella porzione 3 non tradotta del gene. Forme cliniche: C:congenita; G:giovanile; A:adulta; SC:subclinica (nessun segno clinico tranne elettromiogramma anomalo o altro). Genitore che trasmette: madre; padre; ignoto. La forma congenita è trasmessa solo per via materna. Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999

36 Famiglia con DM In nero allele N (5-37 triplette); in rosso allele espanso ( triplette) Anticipazione: l età di esordio diminuisce con il passare delle generazioni mentre aumenta la gravità delle manifestazioni cliniche Gelehrter Collins Ginsburg Genetica Medica Masson 1999

37 Anticipazione in DM Read A e D Donnai, New Clinical Genetics 2 ed., Scion 2011

38 MODELLO di GUADAGNO DI FUNZIONE dell RNA per DM Espansione di sequenze non tradotte: CTG (DM1) o CCTG (DM2) AJHG 74:793, 2004

39 Tentativi di correzione della DM1 con oligonucleotidi antisenso I trascritti endonucleari espansi (CUG exp ) sono insolitamente sensibili al silenziamento antisenso In un modello transgenico murino di DM1 la somministrazione per via sistemica di ASO causa una rapida degradazione dell mrna CUG exp nel muscolo scheletrico La correzione delle caratteristiche fisiologiche, istopatologiche e trascrittomiche della malattia perdura fino a 1 anno dopo la fine del trattamento Wheeler TM et al, Nature 2012

40 Patogenesi malattie da espansione FXS MD1 Poli-Gln (A): Inibizione trascrizionale, (B): RNA tossico, (C): Proteina tossica Strachan e Read, Genetica Molecolare Umana, Zanichelli 2012

41 Effetti della espansione Perdita funzione Guadagno funz Guadagno funzione RNA DM1/2