Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare

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1 Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare Il crescente interesse nella biologia molecolare applicata alla diagnostica è il risultato dei profondi progressi ottenuti nelle conoscenze scientifiche in genetica, rese possibili dall introduzione delle tecniche di amplificazione genica.

2 Il numero di laboratori che utilizzano la tecnologia dell amplificazione genica sta crescendo rapidamente e una conseguenza inevitabile di questa esplosione demografica è la necessità di standardizzazione oltre che di una definizione dell organizzazione dei laboratori.

3 Biologia Molecolare applicata alla diagnostica Microbiologia Genetica Oncologia Farmacogenetica

4 Tecniche impiegate PCR: amplificazione del DNA RT-PCR: amplificazione dell RNA PCR-SEQ: sequenziamento del DNA/RNA, previa amplificazione

5 Campioni sottoposti a tecniche diagnostiche di biologia molecolare nell U.O. Microbiologia nel primo semestre 2005 PCR o altre tecniche di amplificazione del bersaglio 4090 RT-PCR PCR-SEQ 235 Toxoplasma, Antrace, Chlamydia, Micoplasma, HSV 1-2, VZV, CMV, EBV, HHV6, HHV8, Enterovirus, HPV, Parvovirus, HBV, HCV, HIV.

6 Talloni d Achille delle tecniche di amplificazione degli acidi nucleici Elevata sensibilità: rischio di contaminazioni Inattivazione delle DNA polimerasi da impurezze

7 Rischio di contaminazioni Organizzazione del laboratorio e della strumentazione: 1. Area conservazione dei reagenti e allestimento master mix 2. Area preparazione del campione 3. Area assemblaggio miscele di reazione e mplificazione 4. Area analisi amplificati

8 Aspetti preanalitici Necessaria una chiara definizione dei passagi preanalitici Rischi: Degradazione degli acidi nucleici da parte di nucleasi ubiquitarie Sensibilità della PCR rende possibile l amplificazione di materiale contaminante

9 CAMPIONI BIOLOGICI Lavaggio bronchiale Saliva Sciacquo orale Sangue intero Buffy Coat Sangue dessicato Campioni omogenei PCR compatibili Siero o plasma Fluido cerebrospinale Midollo osseo Urina Feci Materiale bioptico

10 Centralità del campione Validazione Assicurazione Qualità Interna Tipo di campione Valutazione Esterna Qualità Approccio integrato allo sviluppo di un saggio PCR diagnostico

11 Campionamento Dove possibile evitare contenitori aperti In caso diverso è importante evitare contaminazione con materiale dell operatore Preferibili contenitori di plastica monouso Sangue e midollo osseo non devono coagulare

12 Conservazione dei campioni I campioni destinati all analisi del DNA dovrebbero essere conservati in tamponi di T 10 -E 1 10 (mm Tris, 1 mm EDTA ph ) a 4 C. I campioni destinati all analisi dell RNA dovrebbero essere conservati in soluzioni tamponate preferibilmente a -80 C o in azoto liquido. Adeguata anche la conservazione sotto forma di precipitato in etanolo a -20 C. Campioni di RNA stabilizzati con ITCG possono essere conservati 7 gg a T ambiente.

13 Otto preparazioni diverse di genoma di Citomegalovirus Conservate a 4 C in TE per 5 anni Amplificazione del gene UL44 (1299pb)

14 Fattori che interferiscono con le procedure analitiche Preparazione dei campioni DNA. Eliminazione incompleta di inibitori: dal campione stesso (eme e precursori) da campionamento inadeguato (eparina) dalla procedura di purificazione (solventi organici) RNA. Eliminazione incompleta di inibitori, Contaminazione con Rnasi Perdita durante la precipitazione

15 Fattori che interferiscono con le procedure analitiche Contaminazioni Dagli stessi ampliconi Da acidi nucleici nativi Dei reagenti Crociate (fra un campione positivo e uno negativo)

16 Fattori che interferiscono con le procedure analitiche Analisi dei prodotti di amplificazione Elettroforesi Digestioni di restrizione Trasferimento degli ampliconi (blotting) Ibridizzazione Sequenziamento

17 Validazione mediante Gold Standard I risultati ottenuti con il saggio PCR dovrebbero essere paragonabili a quelli ottenuti con un metodo di riferimento

18 Validazione mediante Gold Standard Definizioni usate nella validazione di saggi PCR (protocollo MicroVal, ISO 16140, 2003) PCR qualitativa: la risposta al saggio è la presenza o l assenza di un prodotto di PCR (amplicone) rilevato o per osservazione diretta o con strumentazione PCR quantitativa: la risposta al saggio può essere correlata con il numero delle copie di amplicone, determinato dal numero di copie di sequenza bersaglio Limite di determinazione: il minimo numero di microrganismi bersaglio per produrre una risposta PCR positiva

19 Validazione mediante Gold Standard Selettività: misura della inclusione di ceppi bersaglio (fra un ampio spettro di ceppi) ed esclusione (la mancata amplificabilità di un rilevante spettro di ceppi non bersaglio strettamente correlati) Deviazione positiva (DP): caso PCR + a fronte di un risultato - del saggio di riferimento (SR) (falso positivo) Deviazione negativa (DN): caso PCR - a fronte di un risultato + del SR (falso negativo) Accordo positivo (AP): campione PCR + e SR + Accordo negativo (AN): campione PCR - e SR -

20 Validazione mediante Gold Standard Accuratezza diagnostica (AC): grado di corrispondenza tra risultato ottenuto con PCR e SR su campioni identici (AC=(AP+AN)/Numero totale dei campioni Sensibilità diagnostica (SE): capacità del saggio PCR di rilevare il bersaglio quando è rilevato dal SR {(AP/N+)x100} Specificità diagnostica (SP): capacità del saggio PCR di non rilevare il bersaglio quando non è rilevato dal SR {(AP/N-)x100} Robustezza: riproducibilità da parte di altri laboratori che usino altri lotti e altre marche di reagenti, termociclatori e strumentazione validati N+ numero totale di risultati positivi con SR N- numero totale di risultati negativi con SR

21 Controlli di qualità Controlli interni 1 Relativi alla preparazione del materiale da saggiare: DNA Integrità - elettroforesi in gel d agarosio Inibitori - digestione con ER, quindi elettroforesi analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm RNA Integrità - elettroforesi in gel d agarosio non denat. o denaturante Inibitori - analisi spettrofotometrica a 260 e 280nm

22 Controlli interni 2 Controlli di qualità Relativi alla sintesi di cdna e amplificazione: sintesi di cdna Controllo interno (CI) - mrna presenti nel campione (messaggeri ubiquitari) o RNA aggiunto al momento Se il prodotto del CI non viene amplificato: degradazione dell RNA mancato priming della sintesi del cdna assenza di attività enzimatica L aggiunta di quantità note di un CI consente di rilevare diminuita sensibilità dell RT-PCR

23 Controlli di qualità Controlli interni 3 Relativi alla sintesi di cdna e amplificazione: PCR.: Controllo interno (CI) - gene essenziale per la sopravvivenza (fattore di letalità, presente almeno allo stato di emizigote) opure aggiunto al momento In questo caso il CI consente di distinguere tra assenza della sequenza bersaglio e insuccesso della PCR.

24 Controlli di qualità Controlli esterni Controllo esterno positivo: aliquote di DNA appropriate e loro appropriate diluizioni consentono un controllo di qualità della miscela di reazione. E essenziale se si sospetta che il limite di determinazione possa essere inadeguato a rivelare la presenza del bersaglio.

25 Controlli esterni Controlli di qualità Controllo esterno negativo: Campione negativo contenente materiale genetico strettamente imparentato con quello cercato, ma che non può funzionare da bersaglio Bianco: contiene tutti i reattivi ma non il campione da amplificare. Diversi bianchi possono essere inseriti ai passaggi che si ritengano a rischio di contaminazione. Controllo ambientale: provetta contenente la miscela di reazione lasciata aperta durante lo svolgimento di tutto il saggio per la rivelazione di DNA contaminante proveniente dall ambiente.

26 Controlli di qualità Controlli per la valutazione dei risultati Se l amplicone deve essere sottoposto a digestione enzimatica (RFLP) la funzionalità dell enzima usato può essere controllata mediante la scelta di frammenti diagnostici che includano siti di restrizione costanti per lo stesso enzima Elettroforesi: calibratori delle dimensioni degli ampliconi e ampliconi di controllo a concentrazione nota. Devono subire le stesse procedure di preparazione dei campioni

27 Controlli di qualità Controlli per la valutazione dei risultati Controlli per il sequenziamento: le ditte produttrici in genere forniscono opportuni templati per l amplificazione e i corrispondenti primer per il controllo delle reazioni di sequenziamento. Queste reazioni consentono anche di controllarela qualità del gel di sequenziamento. Per l analisi di mutazioni sarebbe opportuno l analisi in parallelo di alleli wt di controllo e campioni da altri membri della famiglia.

28 Valutazione esterna di qualità proficiency testing Methodological proficiency testing Verifica della qualità dei passaggi analitici elementari: Preparazione di DNA/RNA Performance del metodo di amplificazione con primer forniti elettroforesi in gel d agarosio Application based proficiency testing: Realizzabile per saggi eseguiti con relativa frequenza

29 Valutazione esterna di qualità Application based proficiency testing

30 Valutazione esterna di qualità Application based proficiency testing 1. Determinazione di mutazioni genetiche 2. Interpretazione dei risultati Campioni DNA purificato Azioni Determinazione di mutazioni specifiche per: Fibrosi cistica, Poliposi adenomatosa familiare β-talassemia, sindrome dell X fragile

31 Valutazione esterna di qualità Methodological proficiency testing

32 Valutazione esterna di qualità Methodological proficiency testing 1. Estrazione del DNA 2. Performance della PCR 3. Interpretazione dei risultati Campioni DNA standard Campione di sangue DNA di riferimento e Primer Azioni Determinazione spettrofotometrica Estrazione di DNA e det. spettrofotom. PCR in parallelo con il DNA estratto con 3 coppie di primer e analisi dei prodotti

33 Da C. Casini Raggi, Clin. Biochem. (2003); 49:

34 Da C. Casini Raggi, Clin. Biochem. (2003); 49:

35 Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare Il Vostro laboratorio esegue metodiche di biologia olecolare? 17 Si 16 No Il sistema di estrazione degli acidi nucleici utilizzato è: Kit commerciale Protocollo in house Protocollo riconosciuto come gold standard? Si 5 No 6 Non so

36 Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare Il materiale genetico estratto viene controllato per qualità e purezza prima di essere processato? 3 Si 13 No 1 A volte Il laboratorio dispone di uno spettrofotometro? 10 Si 4 No 3 Non Risponde Il laboratorio utilizza enzimi di restrizione? 4 Si 11 No 2 Non Risponde

37 Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare Quale/i metodo/i di amplificazione genica è/sono in uso nel vostro laboratorio? PCR Real RT-PCR PCR-SEQ Time PCR

38 Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare I risultati sono interpretati con l aiuto di: 6 Standard Interno 4 Standard esterno 5 Standard Interno e Standard esterno 1 Metodi propri 1 Non Risponde

39 Questionario Programma VEQ in Biologia Molecolare Viene eseguita l identificazione del genoma di microrganismi patogeni? 10 Si 6 NO 2 Non risponde

40 Programma VEQ biologia molecolare 1. Estrazione del DNA 2. Performance della PCR 3. Interpretazione dei risultati Campioni Campione di sangue DNA di riferimento, Primer ed Enzima di Restrizione Azioni Estrazione di DNA: determinazione quantità e verifica purezza. PCR in parallelo con il DNA estratto con 3 coppie di primer e analisi dei prodotti

41 Programma VEQ biologia molecolare Estrazione del DNA Determinazione spettrofotometrica A 260 /A 280 Digestione con ER e analisi elettroforetica Amplificazione DNA estratto e DNA di riferimento con primer Forniti in doppio Analisi diretta Interpretazione dei risultati Spedizione gruppo VEQ BM S.Orsola - Verifica

42 Variabilià dei saggi di PCR La qualità dei risultati del saggio è influenzata in modo determinante da fattori che riguardano il prelievo del campione, la preparazione del campione e la preparazione della miscela di reazione. I saggi PCR di routine andrebbero controllati a livelli di vari parametri: specificità, limite di determinazione, linearità, precisione, etc.) Il limite di determinazione dovrebbe essere valutato su tutta la procedura, dalla raccolta del campione, alla sua preparazione, all amplificazione dell acido nucleico e alla rivelazione degli ampliconi