1. Chemioattrazione dello spermatozoo da parte dell uovo 2. Esocitosi della vescicola acrosomale (REAZIONE ACROSOMALE)

Transcript

1 1

2 FECONDAZIONE GLI ELEMENTI CHE SI UNISCONO SONO SINGOLE CELLULE, CIASCUNA IN PUNTO DI MORTE, MA CON LA LORO UNIONE SI FORMA UN INDIVIDUO RINGIOVANITO, CHE COSTITUISCE UN ANELLO DELL ETERNO PROCESSO DELLA VITA (Lillie F.R., 1919)

3 FECONDAZIONE Realizza 2 scopi: 1. ricombinazione di geni 2. formazione di un nuovo organismo Sebbene le modalità della fecondazione varino da specie a specie, in generale può essere riassunta nelle seguenti tappe: 1. Chemioattrazione dello spermatozoo da parte dell uovo 2. Esocitosi della vescicola acrosomale (REAZIONE ACROSOMALE) 3. Legame dello spermatozoo alla matrice extracellulare (memb. vitellina o ZP) 4. Passaggio attraverso la matrice extracellulare 5. Fusione delle membrane cellulari di uovo e spermatozoo 6. Fusione del materiale genetico dei due gameti (pronuclei) 7. Attivazione del metabolismo dell uovo per iniziare lo sviluppo

4 I problemi da risolvere sono molto diversi a seconda della modalità riproduttiva FECONDAZIONE ESTERNA FECONDAZIONE INTERNA Riccio di mare (modello storico per lo studio dei meccanismi della fecondazione) Mammifero (meccanismi della fecondazione poco conosciuti fino all avvento delle tecniche di IVF) 4

5 Gli attori della fecondazione

6 EVENTI CHE PORTANO ALLA FUSIONE DELLE MEMBRANE DI SPERMATOZOO E UOVO FECONDAZIONE ESTERNA

7 RICONOSCIMENTO TRA SPERMATOZOO E UOVO: AZIONE A DISTANZA Nel riccio di mare attivazione dello spermatozoo avviene con il rilascio nell acqua. Nella gonade ph=7.2 - spermatozoi inattivi In acqua ph=7.6 - attivazione ATPasi dineinica 1. Attrazione specie specifica dello spermatozoo: chemiotassi Regola il tipo di spermatozoi e il momento della fecondazione (fecondazione esterna) Peptide 14 aa isolato dal jelly di Arbacia punctulata

8 2. Attivazione specie-specifica dello spermatozoo: reazione acrosomale RICONOSCIMENTO TRA SPERMATOZOO E UOVO: CONTATTO DEI GAMETI 2a - esocitosi della vescicola acrosomale (fusione tra membrana cellulare e membrana vescicola acrosomale) 2b - formazione del processo acrosomale Nel riccio di mare il riconoscimento specie-specifico: 1) interazione tra specifici polisaccaridi solfatati del jelly e recettori membrana spermatozoo; 2) interazione 8 tra proteina acrosomale bindina e specifici recettori sulla membrana vitellina

9 RICCIO DI MARE: RECETTORI PER LA BINDINA SULLA SUPERFICIE DELL UOVO Il legame degli spermatozoi non avviene sull intera superficie dell uovo: numero limitato di siti di legame Esistono recettori per la bindina specie specifici sull uovo (glicoproteine di ~ 350 KDa) Nel riccio di mare basta la reazione acrosomiale (esposizione delle molecole di bindina) a promuovere la fecondazione

10 Fusione delle membrane cellulari di spermatozoo e uovo Ingresso dello spermatozoo determina polimerizzazione dell actina nell uovo Formazione del cono di fecondazione 10

11 11

12 INIBIZIONE DELLA POLISPERMIA MONOSPERMIA: condizione normale in cui il nucleo aploide di uno spermatozoo e il nucleo Segmentazione anomala aploide di un uovo contribuiscono a formare il nucleo diploide dell uovo dello riccio ZIGOTE, di mare ristabilendo l assetto cromosomico tipico della specie. dispermico POLISPERMIA: l ingresso di più spermatozoi nell uovo ha conseguenze disastrose Uovo umano dispermico alla prima divisione mitotica. Le specie hanno evoluto modalità che impediscono l unione di più nuclei aploidi

13 BLOCCO RAPIDO ALLA POLISPERMIA Avviene in alcune specie (es. riccio di mare e anfibi, non nella maggior parte dei mammiferi) per variazioni del potenziale di membrana dell uovo: entro 2-3 sec dal legame del 1 spermatozoo passa da -70mV a + 20 mv per l ingresso di ioni Na 2+ Gli spermatozoi non sono in grado di fondersi con membrane che hanno un potenziale di riposo positivo Diminuendo il gradiente di Na+ aumenta la % di uova polispermiche E un fenomeno transitorio, il potenziale di membrana resta positivo solo per 1 min.

14 BLOCCO LENTO DELLA POLISPERMIA Gli spermatozoi legati alla membrana vitellina vengono rimossi mediante REAZIONE DEI GRANULI CORTICALI, blocco meccanico più lento attivo circa 1 min dopo la fusione. Questo processo è attivato da un onda di calcio I granuli corticali si fondono con la membrana plasmatica dell uovo e liberano il loro contenuto nello spazio compreso tra la membrana vitellina e la membrana plasmatica formando la membrana di fecondazione

15 15

16 FORMAZIONE DELLA MEMBRANA DI FECONDAZIONE IN RICCIO DI MARE 1. Una serinproteasi interrompe le connessioni proteiche tra la membrana cellulare e la membrana vitellina e stacca i recettori della bindina con gli spermatozoi legati 2. I mucopolisaccaridi determinano un gradiente osmotico che richiama acqua nello spazio tra membrana plasmatica e vitellina la membrana vitellina si rigonfia e si trasforma in MEMBRANA DI FECONDAZIONE 3. L enzima perossidasi forma legami crociati tra residui di tirosina di proteine adiacenti 4. La proteina ialina forma un rivestimento intorno all uovo a cui si attaccano le estremità di lunghi microvilli e fornisce un sostegno ai futuri blastomeri durante la segmentazione

17

18 Movie Sea urchin fertilization 18

19 LA FECONDAZIONE nei mammiferi

20 La fecondazione in pillole 20

21 Riccio di mare Mammifero

22 TRASPORTO E CAPACITAZIONE DEGLI SPERMATOZOI NEI MAMMIFERI Nei mammiferi le vie genitali femminili hanno un ruolo attivo nel processo della fecondazione: trasporto degli spermatozoi fino alla tuba uterina per attività muscolare dell utero capacitazione degli spermatozoi: modificazioni fisiologiche che li rendono competenti ad attuare la reazione acrosomale e quindi la fecondazione 1. Modificazione della membrana plasmatica degli spermatozoi per rimozione del COLESTEROLO da parte di ALBUMINE presenti nelle vie genitali e aumento di ph 2. Perdita di particolari proteine e carboidrati dalla superficie cellulare dello spermatozoo e smascheramento delle proteine di legame (enzima galattosiltransferasi) alla zona pellucida 3. Uscita di ioni K + e potenziale di membrana più negativo 4. Fosforilazione di proteine (a livello delle tirosine) coinvolte nel legame uovospermatozoo

23 MODELLO IPOTETICO DELLA CAPACITAZIONE DEGLI SPERMATOZOI DI MAMMIFERI? Potenziale di membrana (-) 1. Efflusso di K + : variazione potenziale riposo memb 2. Rimozione colesterolo 3. Attivazione canali con entrata di ioni bicarbonato e calcio 4. Attivazione adenilato ciclasi Alcune proteine fosforilate migrano sulla superficie della testa dello spermatozoo Es. Izumo (prot fusogena)

24 IPERATTIVAZIONE E CHEMIOTASSI NEI MAMMIFERI Gli spermatozoi di alcuni mammiferi subiscono nell utero una iperattivazione mediata dall attivazione di canali del Ca 2+ da parte del camp a livello della coda questa iperattivazione è idonea per il movimento lineare degli spermatozoi nel fluido viscoso delle tube uterine. Spermatozoo di toro non capacitato aderisce alla membrana delle cellule epiteliali della tuba uterina prima di entrare nell ampolla Alcuni fattori presenti nelle tube sembrano imprimere allo spermatozoo un movimento direzionale Questo legame rallenta la capacitazione, prolunga la vita degli spermatozoi e limita l ingresso nell ampolla contribuendo a prevenire la polispermia

25 SPERMATOZOO CAPACITATO INTERAZIONE CON ZP OOCITA REAZIONE ACROSOMIALE

26 LEGAME E RICONOSCIMENTO DEI GAMETI NEI MAMMIFERI La ZONA PELLUCIDA nei mammiferi svolge un ruolo analogo alla membrana vitellina degli invertebrati: lega gli spermatozoi e dà inizio alla reazione acrosomiale La zona pellucida è costituita da 3 glicoproteine principali disposte in una struttura fibrillare: ZP1, ZP2 e ZP3 ZP3 lega inizialmente lo spermatozoo TEST INIBIZIONE spermatozoi incubati con ZP3 purificata: diminuisce la loro capacità di legame con Zona Pellucida rimuovendo le porzioni carboidrate da ZP3 si riduce l affinità di legame dello spermatozzo con ZP3 Spermatozoi incubati con ZP3

27 INTERAZIONE ZP - SPERMATOZOO Nel topo gli spermatozoi capacitati interagiscono con ZP3 REAZIONE ACROSOMIALE Liberazione di enzimi che: MODIFICANO ZP3 impedendo così l interazione con altri spermatozoi creano VARCO NELLA ZONA PELLUCIDA

28 REAZIONE ACROSOMIALE NEI MAMMIFERI Nel punto di attacco gli spermatozoi possono liberare gli enzimi proteolitici e digerire un percorso attraverso lo strato extracellulare: residui carboidrati di ZP3 formano legami crociati con la GALATTOSILTRANSFERASI I, un enzima transmembrana dello spermatozoo questo legame attiva proteina G che induce l apertura di canali del Ca 2+ e quindi l esocitosi

29 ATTRAVERSAMENTO DELLA ZONA PELLUCIDA Durante la reazione acrosomiale la parte anteriore della membrana plasmatica dello spermatozoo viene persa e con essa l interazione con ZP3 ZP3 Nel topo viene realizzato un legame secondario con la zona pellucida tra proteine della membrana interna dell acrosoma (proacrosina) e la glicoproteina ZP2 ZP2 ZP2 reagisce solo con spermatozoi che hanno subito reazione acrosomiale

30 LOCALIZZAZIONE DELLE PROTEINE DEGLI SPERMATOZOI CHE LEGANO ZP3 Nello spermatozoo di topo le proteine di legame a ZP3 sono localizzate sulla membrana plasmatica che ricopre la testa intorno all acrosoma. ZP3 marcata con isotopi radioattivi si lega a spermatozoi di topo capacitati.

31 FUSIONE DEI GAMETI NEI MAMMIFERI Lo spermatozoo prende contatto con l uovo tangenzialmente con la sua porzione in prossimità della zona equatoriale Regione priva di microvilli in cui è stato emesso il globulo polare L interazione di una proteina CD9 presente sull uovo, con una proteina dello spermatozoo sembra determinare la fusione delle membrane TOPI FEMMINA privi del gene CD9 sono infecondi Quale proteina è presente sugli spermatozoi???

32 MOLECOLE ADESIVE 2 1 ADESIONE TRA LE MEMBRANE: Topo: Interazione ZP3 con proteine dello spermatozoo dette Zona adesine -FERTILINA (spermatozoo) interagisce con Integrina a6b1 (oocita). Hp: fertilina promuove anche fusione lipidi membrana -PROTEINE CON PROPRIETA FUSOGENE -CD-9 (oocita) interagisce con IZUMO (spermatozoo) (Inoue et al., 2005 Nature) Topi privi di IZUMO sono sterili. IZUMO è presente anche nell uomo

33 LEGAME CON LA ZONA PELLUCIDA Legame dello spermatozoo con ZP Spermatozoo attraversa la ZP

34 34

35 35

36 36

37 37

38 REAZIONE DEI GRANULI CORTICALI NEI MAMMIFERI Nei mammiferi l esocitosi dei granuli corticali non provoca la formazione di una membrana di fecondazione ma gli enzimi rilasciati (es. N-acetilglucosaminidasi) agiscono modificando i recettori della zona pellucida in modo che gli spermatozoi non possano più iniziare o mantenere il loro legame alla zona pellucida ZONA PELLUCIDA ALTERATA

39 MAMMIFERI

40 ATTIVAZIONE DEL METABOLISMO DELL UOVO La fecondazione oltre che unire due nuclei aploidi determina il risveglio della cellula femminile dal suo stato di torpore metabolico e avvia a una serie di eventi citoplasmatici già programmati Onda di rilascio del Ca 2+ che si propaga a patire dal punto di ingresso dello spermatozoo

41 Il REL circonda i granuli corticali nelle uova di riccio di mare Mammifero (?) Riccio di mare (?)

42 RUOLO DEGLI INOSITOLFOSFATI NEL RILASCIO DEL CALCIO DAL RETICOLO ENDOPLASMATICO PIP2: fosfatidil inositolo difosfato IP3: inositolo trifosfato DAG: diacilglicerolo

43 L aumento della [Ca 2+ ] intracellulare determina il ritorno al ciclo cellulare con RISPOSTE PRECOCI (attivazione della NAD chinasi, aumento del consumo di O 2 ) e RISPOSTE TARDIVE (la riattivazione della sintesi proteica e riattivazione del DNA)

44 FUSIONE DEL MATERIALE GENETICO NEI MAMMIFERI Il processo di migrazione dei pronuclei richiede circa 12 ore. L OOCITA HA I CROMOSOMI IN PIENA METAFASE MEIOTICA II Le oscillazioni delle concentrazioni del Ca2+ Attivano una chinasi che porta alla proteolisi della ciclina ( si sblocca il ciclo celllulare) e delle proteine di coesione (i cromosomi metafasici si staccano) Inattivano la MAP chinasi consentendo la sintesi del DNA La sintesi di DNA avviene separatamente in ciascun pronucleo e quando i due pronuclei si incontrano sui microtubuli costruiti sul centrosoma maschile gli involucri nucleari si disgregano ma non si forma un nucleo unico dello zigote

45 MOVIMENTI DEI PRONUCLEI NELLA FECONDAZIONE DI MAMMIFERO Coda dello spermatozoo Fine meiosi I Si completa meiosi II 15h p.f. i pronuclei sono uniti Condensazione separata dei cromosomi materni e paterni Fuso della I mitosi

46 FECONDAZIONE RIORGANIZZA IL CITOPLASMA DELLA CELLULA UOVO Formazione di una rete di microtubuli che si accresce nella regione vegetativa della cellula. I microtubuli attivano una serie di eventi che determinano l asse dorso-ventrale dell embrione Lo sviluppo è regolato da: 1) Determinanti morfogenetici o molecole di pianificazione sono legate al citoscheletro della cellula e vengono distribuiti nei vari blastomeri 2) Dopo la specificazione una cellula può influenzare cellule adiacenti mediante interazioni