DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIO-MEDICHE, SEZIONE FISIOLOGIA TIODOL VALUTAZIONE DELL ATTIVITÀ ANTI-INFIAMMATORIA

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1 DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIO-MEDICHE, SEZIONE FISIOLOGIA TIODOL VALUTAZIONE DELL ATTIVITÀ ANTI-INFIAMMATORIA Responsabile della ricerca: Prof. V. Cardile Collaboratori: Dott.ssa A.C.E. Graziano

2 INGREDIENTI IMPIEGATI NELLO STUDIO Mix (TIODOL COMPLEX, compresse) Collagene idrolizzato Zinco gluconato Condroitina solfato Metilsulfonilmetano Vitamina D3 Boswelia Selenio metionina Glucosammina solfato

3 SISTEMI BIOLOGICI UTILIZZATI Cheratinociti umani NCTC 2544 stimolati con interferon gamma (200 U/ml) e istamina (10-4 M) Condrociti umani primari stimolati con interleuchina 1beta (10 ng/ml)

4 Cheratinociti? L infiammazione può definirsi come la risposta di un organismo vivente ad agenti (fisici, chimici, biologici) o situazioni che provocano un danno in qualsiasi sede. La pelle è continuamente esposta ad un ampia gamma di attacchi chimici e fisici. La prima barriera protettiva nei confronti degli insulti esterni è costituita dai cheratinociti, le cellule più largamente diffuse nell epidermide. I cheratinociti sono attivamente coinvolti nelle reazioni infiammatorie della pelle mediante l attivazione dei leucociti e la modulazione delle loro funzioni. Durante i processi infiammatori la pelle è infiltrata da linfociti T che possono esercitare effetti citotossici e produrre citochine con funzioni pro-infiammatorie.

5 La pelle

6 Effetti pro-infiammatori di interferon-γ sui cheratinociti

7 Condrociti? rappresentano la componente cellulare della cartilagine Nei Mammiferi durante lo sviluppo La cartilagine forma il primitivo abbozzo fetale della maggior parte dello scheletro Nei Mammiferi adulti: riveste le superfici articolari costituisce i dischi intervertebrali costituisce dischi e menischi intraarticolari dà sostegno ad alcuni organi dell apparato respiratorio e al padiglione auricolare

8 IL TESSUTO CARTILAGINEO È COSTITUITO DA: CONDROBLASTI CONDROCITI MATRICE EXTRACELLULARE E rivestito dal PERICONDRIO (lamina di connettivo fibroso). Parte sub-pericondrale: condrociti di forma appiattita, raramente raggruppati Parte interna del tessuto: condrociti sferoidali riuniti in gruppi isogeni o nidi

9 Cartilagine in sezione P: Pericondrio; C1: Condrociti; C: Condroblasti La matrice è costituita da: 1 acqua fibre collagene proteoglicani acido ialuronico glicoproteine: condronectina lipidi lipoproteine

10 Malattie muscolo-scheletriche Le artropatie infiammatorie e degenerative portano alla comparsa di stress ossidativo-infiammatorio caratterizzato da una distruzione progressiva del tessuto cartilagineo articolare.

11 La cartilagine ed i condrociti sono sottoposti ad uno stress meccanico continuo... Necrosi cellulare sulla superficie Formazione di micro-fessure

12 Apoptosi La cellula implode

13 Osteoartrosi La lamina splendens si usura...si scheggia... si dissolve.

14 La cartilagine calcificata dà luogo a strutture che vengono definite osteofiti

15 Con danni modesti... o molto estesi

16 Pelle Cartilagine Digestione enzimatica Cheratinociti NCTC 2544 Condrociti IFN-γ + Istamina (I + H) IL-1β (Ι) Utili modelli in vitro che rappresentano situazioni patologiche in vivo

17 OBIETTIVO 1 Quali concentrazioni utilizzare? Screening per valutare la citotossicità Test di metabolizzazione dei sali di tetrazolio MTT Concentrazioni 10 e 100 ng/ml, 1 e 100 µg/ml, 1mg/ml

18 MTT E un saggio colorimetrico che sfrutta la capacità delle deidrogenasi mitocondriali di scindere l anello tetrazolico della molecola di MTT (sale di tetrazolio) di colore giallo per dare un sale di formazano violetto. La quantità di formazano prodotta viene misurata allo spettrofotometro ed è proporzionale al numero di cellule vive. Per poter eseguire il saggio le cellule vengono cresciute su di una piastra multi-pozzetto e trattate con concentrazioni crescenti della sostanza da analizzare in triplicato per un tempo predeterminato. Al termine del trattamento, la soluzione contenente l MTT viene aggiunta alle cellule. Dopo circa tre ore, tempo necessario affinché si formi il sale di formazano, viene misurata l assorbanza a 550 nm. I dati così ottenuti vengono normalizzati rispetto al controllo ed utilizzati per costruire le curve dose-risposta.

19 Saggio colorimetrico basato sul reagente MTT Assorbimento delle molecole di MTT da parte delle cellule in esame Metabolizzazione dell MTT a livello mitocondriale da parte degli enzimi deidrogenasi dipendenti da NADH Formazione e precipitazione dei cristalli di formazano che sono insolubili in soluzioni acquose MTT (sale di tetrazolio) NADH formazano N N N N + S N C H 3 NAD + N N H N N S N C H 3 C H 3 C H 3

20 SAGGIO MTT coltura cellulare + MTT incubazione (3 4 ore) a 37 C misurazione dell assorbanza dei campioni tramite ELISA Reader con filtro da 550 nm solubilizzazione dei sali di formazano tramite Isopropanolo 0,1N HCl o DMSO

21 RISULTATI MTT 120 NCTC % of viability l l Control Mix 10 ng/ml l l Mix 100 ng/ml Mix 1 µg/ml l l Mix 100 µg/ml Mix 1 mg/ml Collagene idrolizzato 10 ng/ml Collagene idrolizzato 100 ng/ml Collagene idrolizzato 1 µg/ml Collagene idrolizzato 100 µg/ml Collagene idrolizzato 1 mg/ml l l Zinco gluconato 10 ng/ml Zinco gluconato 100 ng/ml l l Zinco gluconato 1 µg/ml Zinco gluconato 100 µg/ml l Zinco gluconato 1 mg/ml Condroitina solfato 10 ng/ml Condroitina solfato 100 ng/ml Condroitina solfato 1 µg/ml Condroitina solfato 100 µg/ml Condroitina solfato 1 mg/ml Metilsulfonilmetano 10 ng/ml Metilsulfonilmetano 100 ng/ml Metilsulfonilmetano 1 µg/ml Metilsulfonilmetano 100 µg/ml l Metilsulfonilmetano 1 mg/ml Vitamina D3 10 ng/ml l l Vitamina D3 100 ng/ml Vitamina D3 1 µg/ml l Vitamina D3 100 µg/ml Vitamina D3 1 mg/ml Boswelia solfato 10 ng/ml Boswelia solfato 100 ng/ml Boswelia solfato 1 µg/ml Boswelia solfato 100 µg/ml Boswelia solfato 1 mg/ml Selenio metionina 10 ng/ml Selenio metionina 100 ng/ml Selenio metionina 1 µg/ml Selenio metionina 100 µg/ml Selenio metionina 1 mg/ml Glucosammina solfato 10 ng/ml Glucosammina solfato 100 ng/ml Glucosammina solfato 1 µg/ml l Glucosammina solfato 100 µg/ml Glucosammina solfato 1 mg/ml

22 RISULTATI MTT Condrociti % of viability Control Mix 10 ng/ml Mix 100 ng/ml Mix 1 µg/ml Mix 100 µg/ml Mix 1 mg/ml Collagene idrolizzato 10 ng/ml Collagene idrolizzato 100 ng/ml Collagene idrolizzato 1 µg/ml Collagene idrolizzato 100 µg/ml Collagene idrolizzato 1 mg/ml Zinco gluconato 10 ng/ml Zinco gluconato 100 ng/ml Zinco gluconato 1 µg/ml Zinco gluconato 100 µg/ml Zinco gluconato 1 mg/ml Condroitina solfato 10 ng/ml Condroitina solfato 100 ng/ml Condroitina solfato 1 µg/ml Condroitina solfato 100 µg/ml Condroitina solfato 1 mg/ml Metilsulfonilmetano 10 ng/ml Metilsulfonilmetano 100 ng/ml Metilsulfonilmetano 1 µg/ml Metilsulfonilmetano 100 µg/ml Metilsulfonilmetano 1 mg/ml Vitamina D3 10 ng/ml Vitamina D3 100 ng/ml Vitamina D3 1 µg/ml Vitamina D3 100 µg/ml Vitamina D3 1 mg/ml Boswelia solfato 10 ng/ml Boswelia solfato 100 ng/ml Boswelia solfato 1 µg/ml Boswelia solfato 100 µg/ml Boswelia solfato 1 mg/ml Selenio metionina 10 ng/ml Selenio metionina 100 ng/ml Selenio metionina 1 µg/ml Selenio metionina 100 µg/ml Selenio metionina 1 mg/ml Glucosammina solfato 10 ng/ml Glucosammina solfato 100 ng/ml Glucosammina solfato 1 µg/ml Glucosammina solfato 100 µg/ml Glucosammina solfato 1 mg/ml

23 CONCLUSIONE 1 Tutte le sostanze sperimentali risultano non tossiche alla concentrazione di 1 µg/ml

24 OBIETTIVO 2 Determinazione attività anti-infiammatoria su cheratinociti NCTC 2544 e condrociti primari stimolati con citochine pro-infiammatorie Parametri valutati: NF-kB (fattore nucleare kb) COX-2 (cicloossigenasi 2 o prostaglandina-endoperossido sintasi 2) PGE 2 (prostaglandine E 2 ) ICAM-1 (molecola di adesione intercellulare) MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1) IL-8 (interleuchina 8) inos (ossido nitrico sintetasi inducibile) NO (ossido nitrico)

25 RISULTATI Western blot NCTC 2544 NF-kB 1,4 1,2 1 A.D.U. 0,8 0,6 0,4 0,2 0 C I + H I + H + Mix I + H + Collagene idrolizzato I + H + Zinco gluconato I + H + Condroitina solfato I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Vitamina D3 I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina I + H + Glucosammina solfato 1 µg/ml

26 NCTC 2544 A.D.U. 1,8 2 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 C I + H I + H + Mix RISULTATI Western blot I + H + Zinco gluconato I + H + Collagene idrolizzato I + H + Condroitina solfato I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Vitamina D3 I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina I + H + Glucosammina solfato COX-2 1 µg/ml

27 NCTC 2544 RISULTATI ELISA PGE 2 pg/ml C I + H I + H + Mix I + H + Collagene idrolizzato I + H + Zinco gluconato I + H + Condroitina solfato I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Vitamina D3 I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina I + H + Glucosammina solfato 1 µg/ml

28 NCTC 2544 A.D.U. 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 C I + H I + H + Mix I + H + Collagene idrolizzato RISULTATI Western blot I + H + Zinco gluconato I + H + Condroitina solfato I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Vitamina D3 I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina ICAM-1 I + H + Glucosammina solfato 1 µg/ml

29 NCTC 2254 pg/ml C I + H I + H + Mix RISULTATI ELISA I + H + Zinco gluconato I + H + Collagene idrolizzato I + H + Condroitina solfato I + H + Vitamina D3 I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina MCP-1 I + H + Glucosammina solfato 1 µg/ml

30 NCTC 2254 RISULTATI ELISA IL pg/ml C I + H I + H + Mix I + H + Collagene idrolizzato I + H + Zinco gluconato I + H + Condroitina solfato I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Vitamina D3 I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina I + H + Glucosammina solfato 1 µg/ml

31 NCTC ,2 RISULTATI Western blot 1 inos 0,8 A.D.U. 0,6 0,4 0,2 0 C I + H I + H + Mix I + H + Collagene idrolizzato I + H + Zinco gluconato I + H + Condroitina solfato I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Vitamina D3 I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina I + H + Glucosammina solfato 1 µg/ml

32 NCTC 2254 RISULTATI Reazione di Griess NO release NO (µm) C I + H I + H + Mix I + H + Collagene idrolizzato I + H + Zinco gluconato I + H + Condroitina solfato I + H + Metilsulfonilmetano I + H + Vitamina D3 I + H + Boswellia solfato I + H + Selenio metionina I + H + Glucosammina solfato 1 µg/ml

33 Condrociti 1 RISULTATI Western blot NF-kB 0,8 A.D.U. 0,6 0,4 0,2 0 C IL-1beta 10 ng/ml I+Mix I+ collagene idrolizzato I+ zinco gluconato I+condrotin solfato I+ metilsulfonilmetano i+vitamina D3 I+ Boswellia solfato I+ glucosammina solfato I+ Se metionina 1 µg/ml

34 Condrociti A.D.U. 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 RISULTATI Western blot COX-2 C IL-1beta 10 ng/ml I+Mix I+ collagene idrolizzato I+ zinco gluconato I+condrotin solfato I+ metilsulfonilmetano i+vitamina D3 I+ Boswellia solfato I+ glucosammina solfato I+ Se metionina 1 µg/ml

35 Condrociti RISULTATI ELISA PGE 2 pg/ml C IL-1beta 10 ng/ml I+Mix I+ zinco gluconato I+collagene idrolizzato I+condrotin solfato I+metilsulfonilmetano I+Vitamina D3 I+ Boswellia solfato I+ glucosammina solfato I+ Se metionina 1 µg/ml

36 Condrociti 1,6 1,4 RISULTATI Western blot ICAM-1 1,2 A.D.U. 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 C I + Mix IL-1beta 10 ng/ml I + Collagene idrolizzato I + Zinco gluconato I + Condroitina solfato I + Metilsulfonilmetano I + Vitamina D3 I + Boswellia solfato I + Selenio metionina I + Glucosammina solfato 1 µg/ml

37 Condrociti pg/ml C IL-1beta 10 ng/ml RISULTATI ELISA I+Mix I+ zinco gluconato I+collagene idrolizzato I+condrotin solfato I+metilsulfonilmetano I+Vitamina D3 I+ Boswellia solfato I+ glucosammina solfato MCP-1 I+ Se metionina 1 µg/ml

38 Condrociti RISULTATI ELISA IL pg/ml C IL-1beta 10 ng/ml I+Mix I+ collagene idrolizzato I+ zinco gluconato I+condrotin solfato I+ metilsulfonilmetano i+vitamina D3 I+ Boswellia solfato I+ glucosammina solfato I+ Se metionina 1 µg/ml

39 Condrociti 1,2 RISULTATI Western blot inos 1 A.D.U. 0,8 0,6 0,4 0,2 0 C I + Mix I + Zinco gluconato IL-1beta 10 ng/ml I + Collagene idrolizzato I + Condroitina solfato I + Metilsulfonilmetano I + Vitamina D3 I + Boswellia solfato I + Selenio metionina I + Glucosammina solfato 1 µg/ml

40 Condrociti RISULTATI Reazione di Griess NO release 15 NO (µm) C IL-1beta 10 ng/ml I+Mix I+ collag idrol I+ zinco gluconato I+condrotin solfato I+ metilsulfonilmetano I+Vitamina D3 I+ Boswellia solfato I+ glucosammina solfato 1 µg/ml

41 CONCLUSIONI Tiodol (Mix) NCTC Interferon gamma e istamina o Anti- NF-kB COX-2 PGE 2 ICAM-1 MCP-1 IL-8 inos NO Anti-infiammatorio Condrociti + IL-1beta

42 TIODOL Collagene

43 TIODOL Collagene Modifiche della Cartilagine delle articolazioni dopo 3 mesi (sezione dei tessuti*) Progressione senza Tiodol Collagene Progressione con Tiodol Collagene * Oesser S et al. (2007) Osteoarthritis Cartilage 15: C61-C62, 94

44 TIODOL Collagene TIODOL COLLAGENE e rigenerazione dei tessuti della cartilagene nell uomo Tiodol Placebo Giorno 1 Settimana24 Settimana 48 Cartilagine danneggiata Cartilagine sana Significativo incremento della densità dei proteoglicani rilavata con metodiche che utilizzano la fluorescenza