Sistemi genetici batterici e virali. La genetica batterica, coniugazione, trasformazione La genetica virale, trasduzione

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1 Genetica 3

2 Sistemi genetici batterici e virali La genetica batterica, coniugazione, trasformazione La genetica virale, trasduzione

5 Il termine auxotrofia indica l impossibilità per un organismo di sintetizzare un particolare composto organico necessario per la propria crescita, che deve quindi essere assunto necessariamente dall ambiente in aggiunta ai nutrienti energetici forniti dall alimentazione. Molti esseri viventi, incluse piante eterotrofe ed animali, sono auxotrofi per una o più sostanze, come ad esempio vitamine ed amminoacidi essenziali. L auxotrofia è l opposto della prototrofia Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

7 Cromosoma e plasmide Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006 A plasmid is a small DNA molecule within a cell that is physically separated from a chromosomal DNA and can replicate independently. They are most commonly found in bacteria as small, circular, double-stranded DNA molecules. In nature, plasmids often carry genes that may benefit the survival of the organism, for example antibiotic resistance. While the chromosomes are big and contain all the essential information for living, plasmids usually are very small and contain only additional information. Plasmids are considered replicons, a unit of DNA capable of replicating autonomously within a suitable host. However, plasmids, like viruses, are not classified as life.

12 La coniugazione batterica Trasferimento genico attraverso il contatto fisico tra due batteri, di cui il donatore è denominato F + (fertilità positivo) e possiede un pilo di coniugazione, mentre il ricevente è F -. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

19 Caratteristiche del fattore F Tipo Caratteristiche fattore F F + F - Hfr F DNA circolare distinto assente integrato nel cromosoma batterico DNA circolare distinto, porta geni batterici F + x F - due cellule F + Hfr x F - una cellula Hfr e una cellula F - F x F - due cellule F

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29 Fagi virulenti: solo ciclo litico Fagi temperati: ciclo litico e lisogenico (profagi)

31 La trasduzione Trasferimento del DNA mediato da un virus dei batteri (virus dei batteri: batteriofago). Trasduzione generalizzata: qualunque gene Trasduzione specializzata: pochi, specifici, geni

32 E possibile trasferire geni da un batterio a un altro tramite la trasduzione generalizzata (richiesta degradazione cromosoma batterico) Frequenza di trasduzione: da 1/ a 1/ Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

34 I virus a RNA I Virus a RNA sono virus che utilizzano l'rna come materiale genetico. Questo acido nucleico di solito è presente come filamento singolo, sebbene siano presenti gruppi di virus che utilizzano un RNA a doppio filamento. I principali virus patogeni appartenenti ai virus a RNA sono i virus dell immunodeficienza umana (HIV), dell'influenza e dell'epatite virale C. Il virus dell influenza contiene l enzima necessario per la duplicazione del proprio genoma a RNA. Il filamento di RNA virale così sintetizzato serve poi sia da mrna sia da stampo per la sintesi, mediante appaiamento complementare delle basi, di nuove copie del genoma virale. I retrovirus come HIV presentano invece un ciclo riproduttivo più complesso Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

35 I RETROVIRUS Famiglia di virus dotati di membrana lipoproteica esterna contenenti un genoma a RNA, che per replicarsi necessitano di un intermedio a DNA. Una volta entrato nella cellula ospite il genoma a RNA del virus va incontro alla trascrizione inversa nel citoplasma ed il risultante DNA a doppio filamento (detto provirus) viene traslocato nel nucleo e integrato nella cromatina della cellula ospite. Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

36 I retrovirus includono tre gruppi (oncoretrovirus, lentivirus e spumavirus), che comprendono virus in grado di infettare diverse specie animali, compreso l uomo, determinando infezioni croniche, a volte associate a trasformazione neoplastica (oncoretrovirus) o a sindromi lente e progressive, caratterizzate da immunodeficienza e disordini neurologici. Appartengono a questa famiglia, oltre al ben noto virus dell immunodeficienza umana (HIV human immunodeficiency virus ), altri virus oncogeni per l uomo come HTLV-1 e 2 ( Human T-cell Leukemia Virus 1 e 2), ed anche virus della leucemia felina, virus della leucemia murina (topi) di Moloney (MoLV) e del tumore mammario murino. Cellula T infettata da HIV Questa famiglia di virus è stata la prima ad attirare l'attenzione dei biologi molecolari per lo sviluppo di vettori per la terapia genica (vettori retrovirali ). Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

37 I prioni I PRIONI sono gli agenti infettivi responsabili: della Encefalopatia Spongiforme Bovina (BSE) nei bovini delle scrapie nelle pecore della Malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) e la sua variante clinica (vcjd) nell'uomo di altre encefalopatie trasmissibili I Prioni sono proteine normalmente presenti nel cervello e altri tessuti (milza) dei mammiferi, incluso l'uomo. La loro funzione è quella di favorire la trasmissione dei messaggi tra le cellule nervose. Si trasformano in proteine nocive o per mutazione spontanea o per l'arrivo di un prione patologico. Quando il prione nocivo attacca le cellule cerebrali e trasforma i prioni normali questi, a loro volta, attaccano e disgregano le altre cellule, dando luogo al tipico aspetto spongioso del cervello da cui la definizione "encefalopatia spongiforme". Tutte le malattie animali da prioni note influenzano la struttura del Sistema nervoso centrale o di altri elementi neurali dei tessuti, e tutti sono attualmente incurabili e sempre letali. La modalità di infezione del prione è data da una particolare catena proteica alfa e beta ripiegata in maniera scorretta, che induce altre proteine ad assumere la stessa conformazione anomala. Queste proteine sono poi in grado a loro volta di infettare le proteine adiacenti

39 Caratteristiche del MATERIALE genetico Deve contenere informazioni complesse Deve replicarsi in modo fedele e deve essere stabile Deve definire un fenotipo

40 Il DNA

43 1952: Esperimento di Hershey e Chase sul virus T2 che dimostra ulteriormente la natura chimica del materiale genetico Nella diapositiva successiva è descritto l esperimento di Hershey e Chase per vedere se, nel corso della riproduzione del fago, vengono trasmesse le proteine o il DNA. Il risultato indica che la componente proteica non entra nella cellula e non viene trasmessa alla progenie. Di contro, il DNA entra nella cellula e viene trasmesso alla progenie. Per cui è il DNA, e non le proteine, il materiale genetico dei fagi Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

47 Il contributo di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins Ma i due litigavano, per cui non sono riusciti a trovare la spiegazione dei dati che avevano ottenuto. Comunque nel 1962 il nobel è stato dato a Watson, Crick e Wilkins (Franklin morta nel 1957) Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

57 Cromosomi batterici Generalmente circolari.. Assenza di proteine istoniche, ma presenza di alcune proteine che comunque favoriscono il compattamento Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

59 Cromosomi eucariotici Lineari. Necessario elevatissimo compattamento, e possibilità di ridurre il compattamento per replicazione/trascrizione Cromatina: DNA + proteine (soprattutto istoni) Due tipi di cromatina: Eucromatina: subisce i normali processi di condensazione / decondensazione nel corso del ciclo cellulare Eterocromatina: permane estremamente condensata (centromeri, telomeri, cromosoma X inattivo) Le proteine piu abbondanti nella cromatina sono gli istoni: proteine cariche positivamente (attraggono il DNA che è carico negativamente). Circa la metà della massa proteica del cromosoma è formata da una serie eterogenea di proteine non istoniche Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

61 Il centromero Il centromero è formato da particolari sequenze ripetute molte volte. Nel caso sotto, la regione ripetuta più volte è di circa 110 basi. Il centromero è lungo basi. Nell uomo il centromero è lungo centinaia di migliaia di basi. Regione centromerica di Saccharomices cerevisiae Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

62 I telomeri I telomeri stabilizzano i cromosomi e ne impediscono la degradazione. Nella diapositiva è riportata la sequenza nucleotidica dei telomeri eucariotici, che nell uomo è ripetuta da 250 a 1500 volte. Questa lunghezza varia da un cromosoma all altro e da cellula a cellula Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

63 Dimensioni del genoma di vari organismi Fago Lambda Escherichia coli Saccharomices cerevisiae Arabidopsis thaliana Vitis vinifera Homo sapiens Mais (Zea Mais) Cipolla (Allium cepa) Ameba Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

64 Variabilità nelle sequenze di DNA degli eucarioti Nella reazione di rinaturazione il DNA viene tagliato in frammenti lunghi diverse centinaia di basi. Poi si denatura a 100 gradi e si raffredda lentamente, monitorando l OD (DNA doppio filamento ha assorbimento minore a 260nm) Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

65 Curva C 0 t Una curva C 0 t rappresenta la frazione di DNA rimasta a singolo filamento nel corso di una reazione di denaturazione. Il livello di rinaturazione dipende da 2 fattori: 1) Concentrazione iniziale di DNA a singolo filamento (C 0 ). 2) Durata della rinaturazione (t). Concentrazioni piu elevate (o tempi piu lunghi) aumentano la probabilità delle collisioni. Il valore a cui metà del DNA si è riappaiato, è definito C 0 t ½

66 Rinaturazione dipende da concentrazione: il primo scalino rappresenta DNA che si rinatura per valori di C 0 T molto bassi, pertanto DNA presente in mote copie (ripetuto) Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

67 Tipi di sequenze di DNA Sequenze non ripetute (geni) Sequenze moderatamente ripetute sequenze di bp ripetute migliaia di volte : Geni per trna e rrna SINE (short interspersed elements, senza funzione): Alu: ripetizioni di bp, 10 6 copie nel genoma umano, 11% del DNA totale). An Alu sequence is a short stretch of DNA originally characterized by the action of the Alu restriction endonuclease. Alu sequences of different kinds occur in large numbers in primate genomes. LINE (long interspersed elements): lunghe migliaia di basi. In maggioranza trasposoni Sequenze altamente ripetute (satellite) < 10 bp, ripetute centinaia di migliaia di volte

68 Sequenze Alu Una sequenza Alu è un breve tratto di DNA originariamente caratterizzato come sito di taglio riconosciuto dall'endonucleasi Alu, un enzima di restrizione. Sequenze Alu di diversi tipi sono presenti in gran numero nei genomi dei primati. In particolare le sequenze Alu sono gli elementi mobili più abbondanti nel genoma dell'uomo e per questo possono essere utili per distinguere DNA umano per esempio da DNA di topo. Le sequenze Alu misurano in media circa 300 paia di basi e sono quindi classificate come short interspersed element (SINE). Si stima che le sequenze Alu presenti nel genoma umano siano più di un milione e che quindi rappresentino il 10.7% del genoma umano totale. Ciò nonostante meno del 0.5% risultano polimorfiche Lo studio di questi tratti di DNA è importante per la genetica di popolazione dell'uomo e per l'evoluzione dei primati, in particolare per l'evoluzione umana. Infatti, le sequenze Alu formano nei primati un registro fossile relativamente semplice da decifrare in quanto gli eventi di inserzione delle sequenze Alu sono fedelmente trasmessi di generazione in generazione e sono facilmente identificabili. Lo studio di queste sequenze può rivelare quindi relazioni di discendenza in quanto due individui condivideranno una particolare inserzione se hanno un antenato comune. La maggior parte delle sequenze Alu nel genoma umano possono essere riscontrate anche nelle corrispondenti posizioni dei genomi di altri primati, tuttavia circa inserzioni Alu sono tipiche degli esseri umani L'inserzione di sequenze Alu è implicata in diverse malattie ereditarie umane e in varie forme di cancro.

69 I TRASPOSONI (DNA mobile) Quando si verifica un evento di trasposizione, un elemento trasponibile, o trasposone, si sposta da una regione di DNA a un altra. Barbara Mc-Clintock fu la prima a scoprire i trasposoni negli anni 40 durante i suoi studi sulla genetica del mais. Da allora, i trasposoni sono stati trovati in tutti i tipi di organismi, dai batteri all uomo La parte principale di una sequenza di inserzione codifica almeno due proteine che catalizzano la trasposizione. Queste proteine sono note come Trasposasi. Un altra caratteristica di una sequenza di inserzione, in comune con molti trasposoni più complessi, si trova appena fuori dal trasposone stesso. I trasposoni portano infatti su entrambi i lati Ripetizioni fiancheggianti dirette (3-12 basi) che non fanno parte del trasposone e non si spostano con esso ma vengono generate dal processo di trasposizione in corrispondenza del sito di inserzione. Alle estremità di molti ma non di tutti trasposoni, sono presenti inoltre le ripetizioni terminali invertite (9-40 basi) -> forcina Molti trasposoni contengono geni a parte rispetto a quelli necessari per la trasposizione. Questi sono, solitamente, i geni che conferiscono resistenza agli antibiotici. Per esempio, Tn3 contiene un gene che conferisce la resistenza all ampicillina.

70 I TRASPOSONI (DNA mobile) I trasposoni rappresentano fino al 50% del DNA dell uomo Alle estremità di molti ma non di tutti trasposoni, sono presenti le ripetizioni terminali invertite (9-40 basi) -> forcina Su entrambi i lati portano Ripetizioni fiancheggianti dirette (3-12 basi): non fanno parte del trasposone e non si spostano con esso ma vengono generate dal processo di trasposizione in corrispondenza del sito di inserzione. Sequenze variabili ma lunghezza costante. Queste ripetizioni indicano che il TE si inserisce dopo aver effettuato dei tagli a scalino Pierce, GENETICA, e Genetica, principi di analisi formale" Zanichelli

72 Tipi di trasposizione (movimento di un trasposone da una localizzazione all altra) Esistono diversi modelli per spiegare i meccanismi di trasposizione dei trasposoni. Trasposizione replicativa (duplicazione) Trasposizione non replicativa (spostamento) Nel modello replicativo avviene la trasposizione da un cromosoma a un altro o tra due siti lontani di uno stesso cromosoma. Secondo tale modello, la porzione di cromosoma che contiene il trasposone si fonde per breve tempo con la porzione di cromosoma accettrice. A questo punto, il trasposone si duplica, e una delle copie si posiziona nel DNA del cromosoma accettore, mentre l'altra rimane nella porzione donatrice. Questo tipo di trasposizione viene perciò anche chiamata trasposizione replicativa. Nel modello non replicativo (o anche conservativo), il trasposone, in genere composito, si sposta da una posizione all'altra del cromosoma, senza che questo si replichi. Ciò permette lo spostamento fisico del trasposone, dalla posizione iniziale a quella finale. La trasposizione conservativa prevede un taglio netto delle estremità del trasposone e un taglio netto nel DNA ricevente. Il trasposone viene così integrato senza formare ripetizioni fiancheggianti dirette.

73 I trasposoni nei batteri Le sequenze di inserzione batteriche contengono solo gli elementi necessari per la trasposizione. Il primo di questi elementi è un gruppo di sequenze particolari localizzate all estremità del trasposone, una delle quali è la ripetizione invertita dell altra. Il secondo elemento è un gruppo di geni che codificano gli enzimi che catalizzano la trasposizione. La trasposizione avviene con un meccanismo di ricombinazione del DNA del trasposone con quello del sito in cui esso traspone, che viene detto di 'ricombinazione sito-specifica'. Il trasposone si può inserire soltanto in regioni di DNA in cui si trovano brevi sequenze nucleotidiche che fanno da bersaglio per l'inserzione ('siti di inserzione'). La sequenza nucleotidica di tali siti sembra irrilevante e non omologa (cioè non somigliante) ad alcuna specifica sequenza del trasposone. Non occorre quindi affinità tra sequenze del trasposone e sito di inserzione, come invece nella ricombinazione omologa, che avviene tra geni aventi le stesse sequenze nucleotidiche. I trasposoni batterici appartengono a due classi: trasposoni semplici (detti anche di 'classe I') e trasposoni compositi (di 'classe II').

74 Trasposoni batterici semplici (classe I) (sequenze di inserzione) TE (Transposable Element) semplice, costituito da trasposasi e da due sequenze (10-40 bp) simili tra di loro disposte in senso inverso alle due estremita (sequenze di inserzione; IS). Lungo generalmente da 800 a 2000 bp. Ha una trasposizione replicativa. Possiede in pratica solo ripetizioni fiancheggianti, le ripetizioni terminali invertite e il gene per la trasposasi, ma può contenere anche geni importanti, ad es. di resistenza alla penicillina Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

75 Trasposoni batterici compositi (classe II) Sono costituiti da due IS nella stessa direzione o in direzione opposta, che si trovano vicine o traspongono come una sola unita, trasportando con se la parte di DNA compresa tra loro. Fra le due IS si trovano il gene per la trasposasi e frequentemente almeno un gene per la resistenza a un antibiotico. Il Tn3, che è il più studiato fra i trasposoni di classe II, codifica anche per una proteina regolatrice, la quale, mediante repressione, controlla la sintesi della trasposasi, evitandone in tal modo una produzione eccessiva, che non sarebbe utile per un evento quale la trasposizione che avviene con bassa frequenza. Presentano trasposizione conservativa (taglia-incolla senza replicazione) Segmento di DNA che puo portare info aggiuntive es resistenza antibiotici - fiancheggiato da 2 copie di una sequenza di inserzione. Sono indicati con la sigla Tn seguita da un numero Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

76 Mu: un batteriofago trasponibile Alcuni batteriofagi si riproducono per trasposizione. Sebbene non abbia ripetizioni terminali invertite, quando si inserisce nel cromosoma Mu genera brevi ripetizioni fiancheggianti (5 bp). Trasponendo, Mu provoca mutazioni nel sito di inserzione, proprietà caratteristica degli elementi trasponibili Pierce, GENETICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

77 I trasposoni negli eucarioti I trasposoni degli eucarioti sono molto simili, per struttura, a quelli procarioti. Possiedono geni che codificano per le proteine necessarie per la trasposizione e che permettono loro di excidersi e reintegrarsi in vari luoghi del genoma. Oltre ai geni coinvolti nei processi di trasposizione, la maggior parte di essi possiede anche numerosi altri geni, la cui funzione, però, è in larga parte ancora ignota. Come i trasposoni procariotici, possono essere la causa di mutazioni genetiche, inserendosi all'interno di geni funzionali e alterandone, o impedendone, le normali funzioni. Sono stati scoperti trasposoni praticamente in tutti gli organismi eucarioti, ma i più studiati sono quelli delle piante (particolarmente del mais), del moscerino della frutta e dell'uomo. I trasposoni negli eucarioti appartengono a due classi: trasposoni compositi (di 'classe II') retrotrasposoni. I Retrotrasposoni si spostano mediante un intermedio a RNA: il retrotrasposone, costituito comunque da un filamento di DNA inserito in un cromosoma, si replica in un filamento di RNA (mediante trascrizione) e, questo filamento, viene poi copiato a sua volta in uno a DNA, capace di integrarsi in una nuova posizione del genoma. Studi hanno dimostrato che, almeno alcune particolari famiglie di brevi e lunghe sequenze ripetute del genoma umano, mostrano proprietà di trasposizione, in particolare la famiglia denominata Alu

84 La Neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) o malattia di von Recklinghausen fa parte di un gruppo di malattie genetiche multisistemiche e progressive dette Facomatosi o anche sindromi neurocutanee : tumori a carico della pelle e dei nervi. La NF1 ha un'incidenza di 1 su nati ed una prevalenza di circa 1 su individui nella popolazione generale. Si trasmette con modalita autosomica dominante, il 50% dei casi sono sporadici. Il gene NF1 è stato localizzato in sede pericentrometrica del braccio lungo del cromosoma 17. E un gene oncosoppressore di oltre 335 kb di DNA genomico, con almeno 60 esoni, che codifica per una proteina di 2818 aa chiamata neurofibromina che si localizza nei microtubuli citoplasmatici e che svolge una regolazione negativa della crescita cellulare con attività di controllo di attivazione sul ras pathway. Da qui la funzione di soppressore di tumore svolto dalla neurofibromina. Nel 1991 è stato scoperto, in un uomo di 31 anni affetto da neurofibromatosi, che il danno genetico era stato causato da una trasposizione della sequenza Alu in uno degl introni di NF1: errore nello splicing con errata rimozione di un esone. I genitori erano entrambi privi della sequenza Alu in quell introne