A"uazione di protocolli per l analisi prenatale di aneuploidie.

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1 DNA libero circolante nel plasma materno DNA libero circolante: DNA materno + DNA fetale Origine: apoptosi del citotrofoblasto A"uazione di protocolli per l analisi prenatale di aneuploidie Frammentato (143 bp in media) Presente a partire dalla 5a settimana di gravidanza La quantità di cffdna aumenta con l età gestazionale Il DNA di origine fetale è in percentuale variabile : 5-15% del DNA circolante totale (10-20 settimana di gestazione) Francesca Torricelli torricellifr@gmail.com DNA libero circolante nel plasma materno Cara"eris;che cﬀdna Vantaggi Presente nel plasma materno precocemente (4-5 sett) Diagnosi precoce (Lo YM et al 1998) Rapida clearance dopo il parto Applicazioni diagnostiche della NIPD su cffdna Ø Determinazione del sesso fetale nelle gravidanze a rischio per DNA materno malattie genetiche X-linked; Ø Determinazione del genotipo fetale RHD in donne Rh D negative; DNA fetale Ø Malattie autosomiche dominanti (Acondroplasia, Morbo di Gravidanza-specifico Huntigton, ecc) di origine paterna o de novo; (Lo YM et al 1999) Rappresentativo del genoma fetale totale (Lo Y et al 2010) Analisi di qualsiasi regione genomica fetale Ø Malattie autosomiche recessive (βtalassemia, Fibrosi Cistica, ecc) Esclusione della mutazione paterna (Coppia con difetti molecolari diversi ) o analisi indiretta; Lo et al.2009 Trends in Genet. Determinazione del genotipo fetale mediante studio di aplotipi; Liu et al.2016 Trends in Mol. Med. NGS e test prenatali non invasivi CVS o LA DNA fetale libero circolante NGS e test prenatali non invasivi Le nuove tecnologie di sequenziamento consentono di o9enere grandi quan;tà di da; di sequenza in un singolo esperimento Questo approccio consente di identificare le aneuploidie più frequenti sequenziando, mappando e contando le molecole di DNA per evidenziare «variazioni nel numero di copie» di uno specifico cromosoma, a partire da DNA totale circolante nel plasma materno E quindi necessaria una metodica in grado di evidenziare variazioni molto piccole di DNA 1

2 NIPT: PPV e NPV Il valore predibvo posi;vo dipende dalla Sensibilità e dalla Speciﬁcità del test: in par;colare, esso aumenta con l'aumentare di ques; due parametri. É però importante sottolineare che il valore predittivo positivo dipende anche da un fattore indipendente dal test: la prevalenza della malattia nella popolazione sottoposta a screening. PPV = PPV e NPV (Sensibilità x prevalenza) ((Sensibilità x prevalenza)+(1-specificità)x(1-prevalenza)) NPV = Specificità x (1-prevalenza) ((1-sensibilità) x prevalenza + specificità x(1-prevalenza)) Fallimento Test NIPT : percentuali e cause NIPT : A CHE PUNTO SIAMO? Le percentuali di fallimento del test NIPT sono estremamente eterogenee (da 0 a 12%) e non direttamente correlabili al metodo d analisi utilizzato o all epoca gestazionale. Global availability of noninvasive prenatal genetic testing (NIPT) Quali sono le possibili cause di un test NIPT inconclusivo? Inadeguatezza del campione: volume sangue insufficiente; emolisi; errori di etichettatura provette; ritardo nella consegna dei campioni. Cause biologiche/sperimentali: frazione fetale inferiore al 4%; problemi nell estrazione del DNA, nell amplificazione o nel sequenziamento dei campioni; Gil MM et al. UOG 2017 Int J Womens Health 2015 Jan 16;7:

3 Allegato B PRESTAZIONI SPECIALISTICHE PER IL CONTROLLO DELLA GRAVIDANZA FISIOLOGICA, ESCLUSE DALLA PARTECIPAZIONE AL COSTO HCG FRAZIONE LIBERA E PAPP-A. Da eseguire solo in associazione con Incluso: consulenza pre e post test combinato (1 trimestre) ECOGRAFIA OSTETRICA PER STUDIO DELLA TRASLUCENZA NUCALE. Incluso: consulenza pre e post test combinato. ART 59.5 Nelle specifiche condizioni di rischio fetale indicate dall'allegato 10 C, sono escluse dalla partecipazione al costo le prestazioni specialis;che ambulatoriali necessarie ed appropriate per la valutazione del rischio e la successiva diagnosi prenatale, prescri9e dallo specialista. Le regioni e le province autonome individuano le stru"ure di riferimento per l'esecuzione di tali prestazioni, garantendo che le stesse stru9ure forniscano alle donne e alle coppie un adeguato sostegno. Da eseguire esclusivamente tra 11 se\mane + 0 gg e 13 se\mane +6 gg 3

4 ALLEGATO 10C CONDIZIONI DI ACCESSO ALLA DIAGNOSI PRENATALE INVASIVA 1) Rischio procrea;vo prevedibile a priori da valutare in sede di consulenza gene;ca 2) Rischio rilevato in corso di gravidanza: dife\ fetali evidenzia; mediante ecografia, alterazione di parametri biochimici/molecolari rileva; con sistemi valida; ed eroga; presso stru9ure appositamente individuate dalle regioni, predi\vi di patologie fetali e/o cromosomiche/geniche, patologie infe\ve a rischio fetale. Le condizioni per le quali è previsto l accesso alla diagnosi prenatale invasiva sono: 1) Per le indagine citogene;che: probabilità di trisomia 21, o di altre anomalie cromosomiche 1/300 al momento del test per la valutazione del rischio nel primo trimestre (o 1/250 in caso di test nel secondo trimestre) calcolata secondo i metodi indica; dalle Regioni tra quelli basa; sulla età materna in combinazione con altri parametri ecografici fetali e/o di laboratorio. Tale calcolo dovrà essere effe"uato u;lizzando specifici protocolli nell ambito di programmi che garan;scano uniformità di accesso in tu9o il territorio regionale, in Centri individua; dalle singole regioni e so9opos; a verifica con;nua della qualità. L opzione da parte delle Regioni deve essere orientata all adozione di metodi di calcolo del rischio con una maggiore sensibilità diagnos;ca e un minor numero di falsi posi;vi tenuto conto dell evoluzione della ricerca scien;fica e tecnologica. 2) Per le indagini gene;che 3) Per le indagini infe\vologiche ORDINE del Giorno SIGU SANITA 22-Febbraio 2017 Presentazione Nomenclatore Francesca Torricelli ( Firenze ) Presentazione dei da; sullo screening del duo test combinato (protocolli,risulta;,falsi posi;vi e nega;vi, cos; ) Erich Cosmi ( Padova) Presentazione dei da; sullo screening della NIPT/NIPS (protocolli,risulta;, falsi posi;vi e nega;vi,cos; ) Anna Con; (Napoli) Presentazione di proposte di percorsi già ado9a; o in essere di adozione ( Toscana., Liguria, Friuli Venezia Giulia ecc) Discussione Proposta del gruppo di lavoro ristre"o per la prima Bozza del percorso, foglio informa;vo e consensi per la NIPS. NIPT Linee guida Ø Ministero della Salute- Consiglio Superiore di Sanità-Sezione I Linee-Guida Screening prenatale non invasivo basato sul DNA (Non Invasive Prenatal Testing NIPT) Ø Society for Maternal-Fetal Medicine (SMFM) Publications Committee #36: Prenatal aneuploidy screening usingcell-free DNA Am J ObstetGynecol 2015; 212(6):711-6 Ø American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) Cell-free DNA screening for fetal aneuploidy. Committee Opinion No Obstet Gynecol 2015;126:31 7 Ø The International Society for Prenatal Diagnosis (ISPD) Position statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis Benn P et al, Prenat Diagn 2015; 35: Ø The European Society of Human Genetics (ESHG) and American Society of Human Genetics (ASHG) joint policy statement. Non-invasive prenatal testing for aneuploidy and beyond: challenges of responsible innovation in prenatal screening. Dondorp et al, Eur J Hum Genet (2015) 23, ; (2015) Ø Società Italiana Genetica Umana (SIGU) Documento di indirizzo sull impiego di indagini prenatali non invasive 2016 Ø ACMG Practice Resources. Diagnostic cytogenetic testing following positive noninvasive prenatal screening results: a clinical laboratory practice resources of America College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) Cherry AM et al Genetics in Medicine, 2017 Aug; 19 (8):

5 NIPT flowchart NHS-UK High risk >1 in 150 CVS o LA NHS-UK Intermediate risk <1 in 150 NIPT Dutch Minister of Health April 2017 NIPT ﬁrst-;er screening for all pregnancy, second trimester fetal anomaly scan (FAS) e SNP array on CVS/AFC Valutazione del ruolo del test NIPT e della NT eseguita nel primo trimestre per la determinazione di anomalie cromosomiche in un campione di 5306 donne ad alto rischio. Srebniak et al, Human Muta;on 2017 NIPT report: a consensus opinion REFERTO NIPT SECONDO ISO 15189: Informazioni Paziente: NOME e DATA di NASCITA. Informazioni Campione: TIPO DI CAMPIONE, DATA di RACCOLTA del campione e DATA di ricevimento del campione in laboratorio. Informazioni Cliniche: EPOCA GESTAZIONALE della paziente al momento del prelievo (definita mediante ecografia). Informazioni Referto: DATA DI REFERTAZIONE e dati del DESTINATARIO. Al fine di creare in Europa dei controlli di qualità esterni e fornire raccomandazioni per l elaborazione dei risultati NIPT, sono stati invitati 2726 laboratori a fornire due tipologie di referto di NIPT: 1) RISCHIO ELEVATO DI ANEUPLOIDIA FETALE; 2) BASSO RISCHIO DI ANEUPLOIDIA FETALE. Solo 121 laboratori (4,8%) hanno fornito i referti richiesti. I risultati sono stati discussi durante l ISPD 2016 e contestualmente è stato prodotto un Consensus opinion e formulate delle Linee Guida sulla compilazione dei referti NIPT. Informazioni Test di Laboratorio: METODOLOGIA utilizzata (ex.ngs) e LIMITI del test. Risultato del Test: non deve essere utilizzata la Internal System for Cytogenomic Nomenclature poiché si tratta di un test NON diagnostico. Si consiglia l impiego della dicitura: R I S C H I O E L E VAT O O B A S S O R I S C H I O D I ANEUPLOIDIA FETALE In caso di RISCHIO ELEVATO DI ANEUPLOIDIA FETALE deve essere evidenziata la necessità di confermare il risultato con diagnosi prenatale invasiva. Non è stato raggiunto un consenso riguardo all indicazione sul referto dei valori di Frazione Fetale, di PPV e NPV. NB! ACMG 2016 raccomanda di includere FF, DR, sensibilità, specificità, PPV e NPV Performance generali del test Screening by analysis of cfdna in maternal blood in singleton pregnancies could detect: >99% of fetuses with trisomy 21, 98% of trisomy 18 and 99% of trisomy 13 at a combined FPR of 0.13%. The number of reported cases of sex chromosome abnormali;es is too small for accurate assessment of performance of screening. Performance generali del test Trisomia 21 Dati: 1923 gravidanzet21 e gravidanze non-t21 (30 studi). DR generale: 99.7% (95% CI, %) FPR generale: 0.04% (95% CI, %) DR range: 94.4%-100% FPR range: 0%-0.94% Trisomia 21 GEMELLARI Dati: 24 gravidanze T21 (5 studi). DR generale: 100% (95% CI, %) FPR generale: 0.00% (95% CI, 0, %) Trisomia 18 Dati: 563 gravidanzet18 e gravidanze non-t18 (25 studi). DR generale: 97.9% (95% CI, %) FPR generale: 0.04% (95% CI, %) DR range: 87.5%-100% FPR range: 0%-0.22% Trisomia 18 GEMELLARI Dati: 14 gravidanze T18 (3 studi). DR generale: 92,8% FPR generale: 0.00% Trisomia 13 Dati:119 gravidanzet13 e gravidanze non-t13 (23 studi). DR generale: 99.0% (95% CI, %) FPR generale: 0.04% (95% CI, %) DR range: 40.0%-100% FPR range: 0%-0.25% Trisomia 13 GEMELLARI Dati: 1 gravidanza T13 (1 studio). DR generale: 0.00% FPR generale: 0.00% Monosomia X Dati:36 gravidanze non gemellari X0 e 7676 gravidanze XX (11 studi). DR generale: 95.8% (95% CI, %) FPR generale: 0.14% (95% CI, %) DR range: 66.7%-100% FPR range: 0%-0.49% Gil MM et al. UOG 2017 NIPT Riassumendo In gravidanze singole NIPT è superiore in termini di DR, FPR, PPV e NPV a qualsiasi altro metodo di screening combinato per T21, T18, T13 Non raccomandato per altre anomalie cromosomiche/microdelezioni NIPT Posi;vo/high-risk deve andare a procedura invasiva NIPT Nega;vo/low-risk depone fortemente per assenza delle trisomie ricercate In twin pregnancies performance of screening for trisomy 21 is encouraging but the number of cases reported is small. Tu\ i casi con anomalie stru9urali evidenziate con ultrasuoni dovrebbero eseguire test invasivo 5

6 Cara"eris;che: -RIDUZIONE FALSI NEGATIVI -RIDUZIONE FALSI POSITIVI -RIDUZIONE DIAGNOSI INVASIVE -RIDUZIONE ABORTI SPONTANEI lega; alle procedure di prelievo - ATTUALMENTE MOLTO PIÙ COSTOSO rispe9o ai cos; dell a9uale programma di screening prenatale e diagnosi invasiva. Cara9eris;che: -RIDUZIONE FALSI NEGATIVI -RIDUZIONE FALSI POSITIVI -RIDUZIONE DIAGNOSI INVASIVE -RIDUZIONE ABORTI SPONTANEI lega; alle procedure di prelievo -COSTI DA VALUTARE rispe9o ai cos; dei programmi a9ua; al momento nelle varie regioni. Colosi,Peri; 2016 The Journal of Maternal- Fetal and Neonatal Medicine Cara9eris;che: -RIDUZIONE FALSI NEGATIVI -RIDUZIONE FALSI POSITIVI -RIDUZIONE DIAGNOSI INVASIVE -RIDUZIONE ABORTI SPONTANEI lega; alle procedure di prelievo -COSTI DA VALUTARE rispe9o ai cos; dei programmi a9ua; al momento nelle varie regioni Da; occorren; alle Regioni per stabilire il percorso Ø Il N totale di gravidanze ; Ø Il N test combina; Ø Il N di test combina; risulta; ad alto rischio, per questo si potrà considerare il 5-7 % del totale dei test combina; effe9ua;, dato riportato da mol; autori in le9eratura ; Ø Il N di diagnosi invasive da test combinato ad alto rischio fino a 1/ 300 Ø Il N di test combina; con risultato a rischio intermedio 1/301--1/1000 Ø Il N di test NIPT su test combinato con risultato a rischio intermedio (stesso numero) Ø Il N di test Diagnosi Prenatali Invasive su test NIPT con risultato a rischio alto 6

7 CONCLUSIONI Se proponiamo la NIPT a tu"e le donne in gravidanza proponiamo il metodo di screening per le aneuploidie più frequen; con la DR pù alta 98 % e la più bassa percentuale di falsi posi;vi 0,4 % quindi riduciamo le invasive ma perdiamo la percentuale di microdelezioni e riarrangiamen; in quelle donne che nega;ve non vanno all invasiva Se proponiamo il solo test combinato proporremmo un test con una DR più bassa % e con falsi posi;vi più al; 5-6 % di Falsi Posi;vi quindi maggiori diagnosi prenatali invasive Se proponiamo il con;ngentato : eseguiremo il combinato a tu"e le donne in gravidanza e invieremo le donne con alto rischio alla invasiva. Quindi andrà stabilito quale sarà il cut off che consideriamo alto rischio Se 1/300 :: non diminuiamo le invasive, molte saranno False posi;ve ma recuperiamo alcune anomalie cromosomiche Se 1 / 10 diminuiamo le invasive ma perdiamo alcune anomalie cromosomiche Se 1/ 100 aumen;amo le diagnosi invasive trascinandoci maggiori falsi posi;vi Potremmo proporre 1/50 invasiva le donne con basso rischio 1/51-1/1000 andranno al test della NIPT Le donne nega;ve alla NIPT o con un rischio superiore a 1/1001 e oltre a 12 se?mane verranno monitorizzate con una ecografia per la ricerca di marcatori con significato clinico. le donne con presenza di marcatori ecografici con significato clinico andranno verso SNPs Array. In questo modo riduciamo il numero delle invasive e diagnos;chiamo anche le anomalie cromosomiche Cosa vogliamo raggiungere 1. NIPT a tu9e le Donne in gravidanza 2. Ricerca marcatori ecografici a 12 se\mane 3. Invasiva con SNPs Array per i marcatori clinicamente significa;va Cosa ci manca A. Centralizzazione del test NIPT B. Centralizzazione centri di ecografia per marcatori ecografici C. Centralizzazione SNP array i diagnosi prenatale GRAZIE 7