TEORIA DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE. University of Messina, Italy. Chimica Analitica
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- Erica Ranieri
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1 25 TEORIA DELLA SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE
2 Componenti degli strumenti per spettroscopia ottica sorgente stabile di energia radiante selettore di lunghezze d onda che isola una regione limitata dello spettro per la misura uno o più contenitori per il campione un rivelatore di radiazione che converte l energia radiante in un segnale misurabile (generalmente di natura elettrica) un processore ed un registratore del segnale che mostra il segnale trasdotto su una scala metrica, un oscilloscopio, un display digitale o la carta di un registratore
3 Sorgenti di radiazione Per essere adatta a studi spettroscopici, una sorgente deve generare radiazioni di potenza sufficiente ad essere facilmente rilevabile e misurabile; la sua potenza in uscita altresì deve essere stabile per periodi ragionevoli. Esistono due tipi di sorgenti spettroscopiche: sorgenti continue sorgenti a righe
4 Sorgenti continue di radiazione visibile Le lampade tungsteno/alogene stanno incontrando un applicazione sempre crescente nei moderni strumenti spettroscopici per via del loro esteso intervallo di lunghezza d onda ( nm), della maggiore sensibilità e della vita più lunga.
5 Sorgenti continue di radiazione ultravioletta Le lampade al deuterio (e anche ad idrogeno) sono usate per fornire radiazione continua nell intervallo da 160 a 380 nm e sono le sorgenti più comuni per la spettroscopia ultravioletta.
6 Sorgenti continue di radiazione infrarossa La sorgente Globar consiste di una bacchetta (5 per 50 nm) di carburo di silicio. Quando la sorgente è riscaldata a circa 1500 C dal passaggio di elettricità emette radiazione nella regione da 1 a 40 µm.
7 Sorgenti continue di radiazione infrarossa La lampada di Nerst è una bacchetta di ossidi di ittrio e di zirconio avente dimensioni tipiche di 2 per 20 µm. Emette radiazione infrarossa quando riscaldata ad alta temperatura da una corrente elettrica.
8 Sorgenti continue per la spettroscopia ottica
9 Selettori di lunghezza d onda Gli strumenti spettroscopici sono generalmente equipaggiati con uno o più dispositivi per limitare la radiazione da misurare a una stretta banda, assorbita o emessa dall analita.
10 Selettori di lunghezza d onda Esistono due classi di selettori di lunghezza d onda: monocromatori: permettono variazioni della lunghezza d onda in uscita in un intervallo spettrale considerevole filtri: offrono il vantaggio della semplicità, robustezza e basso costo
11 Monocromatori I monocromatori sono di due tipi: uno impiega un reticolo per disperdere la radiazione nelle sue lunghezze d onda competenti, l altro usa un prisma. Al momento sono i monocromatori a reticolo quelli preferenzialmente utilizzati.
12 Monocromatore a reticolo Per scopo illustrativo la radiazione è raffigurata da due lunghezze d onda λ 1 e λ 2 in cui λ 1 > λ 2. Ruotando il reticolo, sia λ 1 che λ 2 possono essere focalizzate sulla fenditura di uscita del monocromatore.
13 Monocromatore a reticolo a piccoli gradini I reticoli a riflessione consistono di una superficie piana e riflettente di alluminio lunga pochi centimetri che presenta un gran numero di solchi paralleli e strettamente spaziati. Per la radiazione ultravioletta/ visibile il reticolo deve avere 1200/1400 solchi per mm mentre per quella infrarossa 10/200 per mm. Raggi diffratto all angolo di riflessione r Raggi monocromatici Ad angolo di incidenza i Normale Al reticolo
14 Reticoli concavi I reticoli concavi permettono la progettazione di un monocromatore senza specchi o lenti ausiliari di collimazione e focalizzazione poiché la superficie concava non solo disperde la radiazione ma la focalizza anche sulla fenditura di uscita. Inoltre la radiazione del numero di superfici ottiche aumenta l energia in uscita dai monocromatori che presentano un reticolo concavo.
15 Reticoli olografici I reticoli olografici vengono realizzati rivestendo una lastra di vetro piana con un materiale fotosensibile. I fasci provenienti da una coppia di laser identici colpiscono la superficie di vetro ricoperta. Le frange di interferenza risultanti dai due fasci sensibilizzano la fotoresistenza causando lo scioglimento di alcune aree e la formazione di una struttura scanalata. L alluminio viene quindi depositato sotto vuoto. Si possono fabbricare reticoli con anche 6000 linee/mm
16 Filtri Il tipo più comune di filtro d assorbimento è un pezzo di vetro colorato su un supporto. Filtri di questo tipo hanno ampiezze di banda effettive da 50 fino a 250 nm ed hanno picchi di trasmittanza più bassi di quelli mostrati dai filtri ad interferenza.
17 Filtri Qui di seguito vengono paragonate le caratteristiche di trasmissione di un filtro di assorbimento e di un filtro ad interferenza.
18 Rivelatori e trasduttori di radiazioni Il rivelatore è un dispositivo in grado di indicare l esistenza di un qualche fenomeno fisico. Anche l occhio umano può essere considerato un rivelatore: esso converte la radiazione visibile in un segnale elettrico che è trasmesso al cervello attraverso la catena di neuroni nel nervo ottico.
19 Rivelatori e trasduttori di radiazioni Il trasduttore è un tipo speciale di rivelatore che converte segnali come intensità luminosa, ph, massa e temperatura in segnali elettrici che possono essere amplificati e convertiti in numeri proporzionali alla grandezza del segnale originale.
20 Trasduttori E essenziale che il segnale elettrico prodotto dal trasduttore sia direttamente proporzionale alla potenza P del raggio: G = KP + K G = risposta elettrica del rivelatore in unità di corrente, resistenza o potenziale P = potenza del raggio K = costante di proporzionalità che misura la sensibilità in termini di risposta elettrica per unità di potenza radiante K = corrente di fondo (risposta piccola e costante presente anche quando nessuna radiazione colpisce la superficie del trasduttore o rivelatore)
21 Trasduttori Esistono due tipi di trasduttori: un tipo risponde ai fotoni, l altro al calore. I rivelatori fotonici si basano sull interazione della radiazione con una superficie radioattiva per produrre elettroni (fotoemissione) o per promuovere elettroni a stati di energia in cui essi conducono elettricità (fotoconduzione). Solo le radiazioni ultravioletta, visibile e nel vicino infrarosso hanno energia sufficiente per promuovere questi processi.
22 Trasduttori La radiazione infrarossa è rivelata mediante i rivelatori di calore misurando l aumento di temperatura di un materiale annerito, posizionato nel cammino del raggio, o misurando l aumento di conducibilità elettrica di un materiale fotoconduttore quando questo assorbe la radiazione infrarossa.
23 Tabella riassuntiva dei maggiori rivelatori per spettroscopia
24 Rivelatori fotonici Fototubi Fotomoltiplicatori Fotodiodi al silicio Celle fotovoltaiche
25 Fototubi Applicando un potenziale tra gli elettrodi, i fotoelettroni emessi fluiscono all anodo, producendo una corrente (fotocorrente) che è velocemente amplificata e mostrata su uno schermo e registrata.
26 Tubi fotomoltiplicatori E simile nella costruzione al fototubo ma è più sensibile. Gli elettroni emessi sono accelerati verso un dinodo (1) mantenuto ad un potenziale di circa 90 V più elevato rispetto al catodo e cosi via su tutti i dinodi rimanenti producendo per ciascun fotone da 10 6 a 10 7 elettroni. Tale cascata di elettroni è infine raccolta all anodo.
27 Fotodiodi al silicio Hanno acquisito notevole importanza recentemente perché è possibile affiancarne, su un singolo chip di silicio, 1000 o più. Con uno o due di questi rivelatori a serie di diodi posti lungo la lunghezza del piano focale di un monocromatore è possibile monitorare simultaneamente tutte le lunghezze d onda, realizzando così la spettroscopia ad alta velocità. Il silicio cristallino è un semiconduttore. A temperatura ambiente questa struttura ha un agitazione termica
28 Celle fotovoltaiche E il piú semplice trasduttore di radiazione ed è costituito da un elettrodo di rame o di ferro sul quale è depositato uno strato di un materiale semiconduttore come selenio o rame(i) ossido. La cella fotovoltaica tipica ha sensibilità massima a circa 550 nm, con una risposta che cade a circa il 10% del massimo a 350 e 750 nm.
29 Rivelatori termici I rivelatori fotonici precedentemente esposti non possono essere utilizzati per misurare la radiazione infrarossa poiché i fotoni di queste frequenze non hanno energia sufficiente a produrre fotoemissione di elettroni; come conseguenza devono essere usati i rivelatori termici.
30 Rivelatori termici I rivelatori termici consistono di una sottile superficie annerita che si riscalda assorbendo radiazione infrarossa. L aumento di temperatura è convertito in un segnale elettrico che è amplificato e misurato. Le prestazioni dei rivelatori termici sono decisamente inferiori a quelle dei rivelatori fotonici.
31 Rapporto segnale-rumore Il segnale in uscita dallo strumento fluttua in maniera casuale e proprio tali fluttuazioni limitano la precisione dello strumento. Il segnale è il valore medio dell uscita di un dispositivo elettronico, mentre il rumore è la misura della deviazione standard del segnale.
32 Rapporto segnale-rumore Il rapporto segnale-rumore (S/N) viene usualmente definito come il rapporto tra il valor medio del segnale in uscita e la sua deviazione standard ed è considerato un importante parametro di merito per gli strumenti analitici e per altri tipi di dispositivi elettronici.
33 Rapporto segnale-rumore Il comportamento segnale-rumore è mostrato nello spettro riportato qui a fianco relativo all emoglobina. Lo spettro in basso ha S/N = 100 e si possono facilmente osservare i picchi a 540 nm e 580 nm. Con la diminuzione di S/N i picchi appaiono scarsamente visibili; per valori di S/N = 2 e S/N = 1 i picchi scompaiono nel rumore e non sono identificabili.
34 Contenitori per il campione I contenitori per il campione sono chiamati cellette o cuvette e devono avere finestre costruite con un materiale trasparente nella regione spettrale d interesse. Il quarzo o silice fusa è richiesto per la regione ultravioletta(sotto i 350 nm) e può essere usato nella regione visibile e fino a circa 3000 nm nell infrarosso.
35 Contenitori per il campione La qualità dei dati spettroscopici dipende criticamente dal modo in cui le cuvette accoppiate sono usate e conservate. Impronte digitali, grasso o altri depositi sulle pareti alterano in maniera marcata le caratteristiche di trasmissione di una cuvetta.
36 Strumenti per misure di assorbimento ottico Sono due i tipi di strumenti utilizzati per misure di assorbimento con radiazione ultravioletta, visibile o infrarossa: spettrofotometri fotometri
37 Differenze tra spettrofotometri e fotometri Gli spettrofotometri utilizzano un monocromatore a reticolo o a prisma per selezionare una stretta banda di radiazione per le misure. I fotometri utilizzano a tale scopo un filtro di assorbimento.
38 Differenze tra spettrofotometri e fotometri Gli spettrofotometri offrono il vantaggio considerevole della possibilità di variare in modo continuo la lunghezza d onda utilizzata rendendo possibile la registrazione dell intero spettro di assorbimento. I fotometri hanno di contro il vantaggio della semplicità, robustezza e basso costo.
39 Spettrofotometri nell ultravioletto/visibile Esistono tre categorie di strumenti utilizzabili per la spettrofotometria ultravioletta/visibile: strumenti a raggio singolo strumenti a doppio raggio strumenti multicanale
40 Strumenti a raggio singolo La figura a fianco riporta lo schema di uno strumento semplice e poco costoso, lo Spectronic 20, progettato per la regione visibile dello spettro. Il suo intervallo spettrale va da 340 a 625 nm.
41 Strumenti a raggio singolo Lo Spectronic 20 ha una sorgente di luce a filamento di tungsteno alimentata con un alimentatore stabilizzato. L intensità della radiazione della lampada è sufficientemente costante da fornire dati di assorbimento riproducibili.
42 Strumenti a raggio singolo La radiazione dalla sorgente passa attraverso una fenditura fissa e giunge sulla superficie di un reticolo di riflessione. La radiazione diffratta passa attraverso la fenditura di uscita fino alla cuvetta del campione o del riferimento ed infine al fototubo.
43 Strumenti a raggio singolo Il segnale elettrico amplificato dal rivelatore alimenta un contatore dotato di una scala lineare in trasmittanza percentuale; lo strumento è dotato anche di una scala logaritmica calibrata in assorbanza.
44 Strumenti a raggio singolo Per avere una lettura di trasmittanza percentuale il puntatore del contatore è prima azzerato con il compartimento del campione vuoto, in modo tale che lo schermo blocchi il raggio e nessuna radiazione raggiunga il rivelatore. Il procedimento è detto calibrazione o aggiustamento dello 0% di T.
45 Strumenti a raggio singolo Una volta effettuata la calibrazione o aggiustamento dello 0% di T si inserisce una cuvetta contenente il bianco nel portacampione e il puntatore è portato in corrispondenza del segno 100% di T corregendo la posizione della finestra di controllo della luce e dosando la quantità di luce che raggiunge il rivelatore. Il procedimento è detto calibrazione o aggiustamento del 100% di T.
46 Strumenti a raggio singolo Una volta effettuata sia la calibrazione dello 0% di T sia la calibrazione del 100% di T il campione viene posto nel compartimento della cuvetta e la trasmittanza percentuale o l assorbanza viene letta direttamente sulla scala del contatore.
47 Strumenti a doppio raggio Esistono due tipi di strumenti a doppio raggio: strumento a doppio raggio con raggi separati nello spazio strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo
48 Strumento a doppio raggio con raggi separati nello spazio La figura sottostante illustra uno strumento a doppio raggio nello spazio in cui i due raggi vengono prodotti nello spazio mediante uno specchio a forma di V detto beam splitter.
49 Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo In questo secondo tipo di strumento i raggi luminosi sono separati nel tempo per la rotazione di uno specchio a settori che dirige l intero fascio dal monocromatore prima attraverso il riferimento e poi attraverso il campione.
50 Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo Gli impulsi di radiazione vengono ricombinati da un secondo specchio a settori che trasmette un impulso al rivelatore e riflette l altro.
51 Strumento a doppio raggio con raggi separati nel tempo Lo strumento precedentemente illustrato è del tipo ad azzeramento; il raggio che passa attraverso il solvente è attenuato finchè la sua intensità non eguaglia quella del fascio che passa attraverso il campione. L attenuazione viene eseguita con un cuneo ottico la cui trasmissione decresce linearmente con la sua lunghezza.
52 Strumenti a doppio raggio Gli spettrofotometri a doppio raggio offrono il vantaggio di compensare tutte le fluttuazioni, tranne quelle di durata molto breve, nell uscita radiante della sorgente nonché la deriva del rivelatore e dell amplificatore.
53 Strumenti multicanale Gli spettrofotometri multicanale, o a serie di diodi, permettono la registrazione rapida di un intero spettro ultravioletto e visibile. Il cuore di questi strumenti è rappresentato da un numero elevato di diodi di silicio posti l uno accanto all altro su una singola piastrina di silicio.
54 Strumenti multicanale Le piastrine generalmente sono lunghe da 1 a 6 cm mentre la larghezza dei singoli diodi varia da a mm. Ponendo una o due di queste serie di diodi lungo il piano focale di un monocromatore a reticolo, tutte le lunghezze d onda possono essere registrate contemporaneamente e i dati per un intero spettro collezionati e memorizzati in un secondo o meno.
55 Strumenti multicanale Qui di seguito viene mostrato un diagramma ottico di un tipico spettrofotometro multicanale nell ultravioletto/visibile.
56 Strumenti multicanale Grazie all utilizzo di questi strumenti la radiazione in uscita è molto più intensa di quella di uno spettrofotometro tradizionale e di conseguenza la sola lampada al deuterio può servire come sorgente sia per la regione dell ultravioletto che per quella del visibile (fino a 820 nm).
57 Strumenti multicanale Una singola scansione da 200 a 820 nm con uno strumento di questo tipo richiede 0.1 s. Per migliorare la precisione delle misure la scansione viene eseguita per un secondo o più e i dati sono acquisiti dal computer e mediati con quelli della scansione successiva. I ridotti tempi di esposizione del campione riducono la fotodecomposizione dello stesso anche se esso si trova tra sorgente e monocromatore.
58 Spettrofotometri nell infrarosso Sono due i tipi di spettrofotometri utilizzati in spettroscopia infrarossa: strumenti dispersivi strumenti in trasformata di Fourier
59 Strumenti dispersivi Differiscono dallo spettrofotometro a doppio raggio per la posizione del portacampione rispetto al monocromatore; le cuvette sono posizionate fra la sorgente e il monocromatore poiché la radiazione infrarossa non è sufficientemente energetica da provocare decomposizione.
60 Strumenti dispersivi Le sorgenti infrarosse sono costituite da solidi riscaldati piuttosto che lampade al deuterio o al tungsteno. I reticoli infrarossi sono più grossolani di quelli utilizzati per la radiazione ultravioletta/visibile. I rivelatori infrarossi rispondono al calore più che ai fotoni.
61 Strumenti in trasformata di Fourier Nei primi anni 70 gli spettrofotometri in trasformata di Fourier erano molto ingombranti e altrettanto costosi per cui il loro utilizzo era limitato ad applicazioni speciali per le quali le loro caratteristiche uniche risultavano essenziali.
62 Strumenti in trasformata di Fourier Adesso le dimensioni sono state ridotte a dimensioni da banco, i prezzi sono più accesibili e la facilità ed affidabilità nell utilizzo li sta facendo diventare gli strumenti di scelta nella maggior parte dei laboratori. Gli strumenti in trasformata di Fourier non contengono elementi dispersivi e tutte le lunghezze d onda sono rivelate e misurate contemporaneamente.
63 Interferometro di Michelson
64 Interferenza di due fronti d onda monocromatiche
65 Interferenza di due fronti d onda monocromatiche
66 Spettro di una sorgente Di luce continua Interferogramma
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