Jessica Caprioli Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri Centro di ricerche cliniche per le Malattie Rare Aldo e Cele Daccò, Ranica

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Bartolomeo Mura
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1 Jessica Caprioli Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri Centro di ricerche cliniche per le Malattie Rare Aldo e Cele Daccò, Ranica Dipartimento di Medicina Molecolare

2 Genetica: metodi di studio e applicazioni in medicina

3 Come è organizzata questa lezione Introduzione Diapositive teoriche: sfondo blu Diapositive relative ad un esempio reale: sfondo azzurro

4 Che cosʼè la genetica Eʼ la scienza che studia i geni e in particolare la loro: Struttura Funzione Trasmissione Si occupa inoltre di identificare le alterazioni dei geni che producono malattie e come queste alterazioni vengono trasmesse.

1866 Gregor Mendel (1822-1884) pubblica il suo lavoro Experiments in Plant Hybridisation e stabilisce le leggi dellʼereditarietà.

5 1866 Gregor Mendel ( ) pubblica il suo lavoro Experiments in Plant Hybridisation e stabilisce le leggi dellʼereditarietà. - dominanza (F1 omogenea per un dato carattere) - segregazione dei caratteri (incrociando individui della F1 in carattere recessivo ricompare nella F2) - assortimento independente dei caratteri (segue la trasmissione di due caratteri diversi nelle generazioni)

1908 Archibald E. Garrod (1857-1936) postula che i difetti genetici causano molte malattie ereditarie.

6 1908 Archibald E. Garrod ( ) postula che i difetti genetici causano molte malattie ereditarie. A causa di un difetto genetico, i pazienti con alcaptonuria sono privi di un enzima del metabolismo. Il risultato di tale deficit è un accumulo di un composto chimico che rende scure le urine.

7 1953 James Watson e Francis Crick scoprono la struttura tridimensionale del DNA e subito dopo ne deducono il meccanismo di replicazione. DNA

LA STRUTTURA DEL DNA Lineare, a doppia elica: due catene attorcigliate, orientate in senso opposto lʼuna rispetto allʼaltra Struttura portante di ciascuna catena è composta

8 LA STRUTTURA DEL DNA Lineare, a doppia elica: due catene attorcigliate, orientate in senso opposto lʼuna rispetto allʼaltra Struttura portante di ciascuna catena è composta da un polimero costante: zuccherofosfato-zucchero-fosfato Ad ogni zucchero (desossiribosio) si lega una base o nucleotide 4 basi: Adenina (A) Citosina (C) Guanina (G) Timina (T)

9 Ogni uomo è formato da 100 miliardi di cellule Ogni cromosoma è un piccolo bastoncello formato da una lunga molecola attorcigliata su se stessa, il DNA Ogni cellula contiene nel proprio nucleo 46 cromosomi: 23 di origine paterna e 23 di origine materna DNA

Il genoma è organizzato in 46 cromosomi (capitoli del

Ciascun cromosoma è lungo circa 50 mm e quindi in ogni

10 Il genoma è organizzato in 46 cromosomi (capitoli del codice) e i geni sono contenuti nei cromosomi. Ciascun cromosoma è lungo circa 50 mm e quindi in ogni cellula sono contenuti circa 2 m di DNA. Il codice genetico è il manuale di istruzioni per il corretto funzionamento della cellula 15 February February AGCTAACTGG TACTAGTCAGGTA CTCCTAGCA..

11 CHE COSA SONO I GENI Il codice genetico è il manuale di istruzioni per il corretto funzionamento della cellula I geni sono le istruzioni necessarie alla cellula per compiere tutte le sue funzioni vitali..agctaactggtactagt CAGGTACTCCTAGCA.. DNA

12 Dal gene alla proteina La funzione principale di ogni gene è la formazione di proteine Transcription Funzioni di una proteina: - strutturale - enzimatica - di controllo Transcribed strain Growing polypeptide chain Nucleus Cytoplasm Anticodon trna Translation Codon

14 GENI PROTEINE Gene alterato Proteine alterate Malattia Predisposizione alla malattia

15 Le mutazioni

16 Come si possono identificare le mutazioni? La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse Individuazione del gene mutato 3) Studio del DNA e identificazione della mutazione 4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione

17 A cosa serve identificare le mutazioni? A compiere una diagnosi corretta A identificare i soggetti a rischio (medicina preventiva)

18 1) Studio delle famiglie sono causate da un singolo gene

19 Ripercorriamo con un esempio quanto visto finora LA SINDROME EMOLITICO-UREMICA Malattia multisistemica caratterizzata da anemia emolitica e trombocitopenia, con predominante, ma non esclusivo, coinvolgimento renale.

20 male female = dead = unaffected to date = affected = probably affected = spontaneous abortion

21 La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse - Quali sono le caratteristiche della patologia? - Eʼ possibile supporre che alcune proteine e quindi alcuni geni possano essere coinvolti? In altre parole, abbiamo uno o più geni candidati?

22 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage I MARCATORI POLIMORFICI I MICROSATELLITI PRIMER RIPETIZIONI CA PRIMER individui a b c d 24 ripetizioni 23 ripetizioni 22 ripetizioni 21 ripetizioni

23 La PCR Denaturazione a 94

24 Annealing dei primers

Ripetendo questo procedimento per 20-35 volte si ottengono più di 2.000.

25 Ripetendo questo procedimento per volte si ottengono più di di copie del frammento di DNA di interesse che può essere visualizzato facilmente e utilizzato per il sequenziamento.

26 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage Chromosome 1 1q32 Gene di interesse D1S412 D1S2816 D1S D1S F F M M F M F M FM I due soggetti affetti ereditano dal padre lo stesso tratto cromosomico nellʼintorno del gene di interesse: è probabile quindi che questo sia il gene responsabile della malattia in questa famiglia.

27 La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse - A volte non è possibile individuare alcun gene candidato. - In questi casi è possibile estendere lʼanalisi di linkage a tutto il genoma, fino ad individuare la regione candidata. Allʼinterno di tale regione si cercherà poi il gene responsabile della malattia.

28 La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse Individuazione del gene mutato 3) Studio del gene e identificazione della mutazione 4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione

30 Il sequenziamento Normale Mutato TCT TTC ATC ATG TTC TCC Ser Phe Ile Met Phe Ser TCT TTC ATC ACG TTC TCC Ser Phe Ile Thr Phe Ser

sani Analisi genetiche Normale G A C A C A A T T G T C T G T

31 Caso clinico Paziente di 21 anni in emodialisi in seguito a ripetuti episodi di SEU Fratello con storia di SEU Genitori sani Analisi genetiche Normale G A C A C A A T T G T C T G T Asp Thr Ile Val Cys Mutato A A T T G T C T G T G A Asn Cys Leu Stop

32 COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA? Individuazione del genotipo Comprensione del difetto biologico Terapia mirata

33 C3b Fattore B Cellula batterica Il sistema del complemento si attiva MCP C3b Fattore B Fattore H Cellula umana nucleo Il sistema del complemento non si attiva Le cellule dell organismo sono protette

34 Fattore H Prodotto principalmente dalle cellule del fegato Fattore H

35 COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA? Individuazione del genotipo Comprensione del difetto biologico Terapia mirata: il trapianto di rene non funziona, ma è possibile ad esempio infondere la proteina normale (come lʼinsulina nel caso dei diabetici)

36 MCP C3b + Fattore I MCP C3b inattivato Cellula umana nucleo Cellula umana nucleo

37 MCP normale MCP alterato Cellula umana nucleo MCP, mediana dell intensità di fluorescenza Paziente Fratello Padre Soggetti con mutazione Madre ( ) ( ) Controlli dializzati Controlli sani

38 MCP

39 E possibile che la disfunzione in MCP, che e una proteina di membrana altamente espressa nel rene, possa essere corretta trapiantando un rene normale?

40 CASO CLINICO: B.A. una giovane donna con SEU Agosto 1994, a 25 anni: Diagnosi: SEU Gennaio 1995: Progressivo deterioramento della funzione renale Severa, intrattabile ipertensione Nefrectomia bilaterale: Giugno 1995: Remissione completa dei processi microangiopatici Pressione sanguigna normalizzata, emodialisi Riceve un trapianto di rene Nessun segno di ricorrenza, fino ad oggi buona funzione renale Ottobre 2003: analisi genetiche Nessuna mutazione al Fattore H Mutazione nel gene di MCP

41 COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA? Individuazione del genotipo Comprensione del difetto biologico Terapia mirata

46 Details of a Single Feature

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