TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE VEGETALI: PIANTE TRANSGENICHE

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1 TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE VEGETALI: PIANTE TRANSGENICHE

2 Perché manipolare geneticamente le cellule vegetali Per studiare la funzione di geni e proteine tipici degli organismi vegetali Per produrre piante transgeniche

3 Perché creare piante transgeniche Per la produzione di bioreattori: Anticorpi Farmaci Per migliorare le caratteristiche agronomiche: Resistenza a erbicidi Resistenza a patogeni (virus, insetti, funghi, batteri) Per modificare le caratteristiche produttive: Per modificare le caratteristiche produttive: Maturazione ritardata Miglioramento del valore nutritivo (amido, oli, vitamine) Miglioramento del sapore e dell aspetto dei frutti Miglioramento della pigmentazione dei fiori

4 Coltivazione in vitro di cellule vegetali Colture di callo Colture cellulari in sospensione Protoplasti Rigenerazione di piante fertili

5 Trasferimento genico in cellule vegetali Agrobacterium tumefaciens (stabile) Trasferimento diretto (stabile e transiente) produzione di protoplasti gene gun elettroporazione Virus vegetali (transiente)

6 Agrobacterium tumefaciens

7 Trasformazione da Agrobacterium

8 Il plasmide Ti (tumor( inducing) T-DNA: Transforming DNA Le opine sono derivati di amminoacidi utilizzati da A. tumefaciens come fonte di carbonio e azoto

9 Elementi per il trasferimento del T-DNAT Elementi in cis: sequenze confinanti destra e sinistra costituite da due ripetizioni dirette di 25 bp che definiscono i confini del T-DNA Elementi in trans: geni vir (virulenza) codificano proteine ed enzimi coinvolti nei processi per il trasferimento stabile del T-DNA nel genoma della cellula vegetale: Escissione del T-DNA dal plasmide Ti Trasferimento del T-DNA dal batterio alla cellula vegetale ospite per coniugazione Integrazione del T-DNA in un punto casuale del genoma della cellula vegetale ospite per ricombinazione non omologa

10 Il plasmide Ti come vettore Il plasmide Ti disarmato Ai fini del clonaggio il plasmide Ti viene privato dei geni che causano la trasformazione neoplastica delle piante

11 Ricombinazione omologa tra due plasmidi: a) plasmide di E. coli contenente: il T-DNA (transgene e il marcatore di selezione tra le sequenze di confine) gli elementi tipici di un plasmide batterico (ori, polylinker, marcatori di selezione batterici) Regione di omologia per la ricombinazione b) plasmide Ti disarmato, necessario per fornire i geni vir, contenente la regione di omologia per la ricombinazione Vettori di cointegrazione Ricombinazione omologa

12 Vettori binari Utilizzo di due plasmidi: a) plasmide di E. coli contenente il T-DNA (transgene e il marcatore di selezione tra le sequenze di confine) gli elementi tipici di un plasmide batterico (ori, polylinker, marcatori di selezione batterici) l ori e un marcatore di selezione di A. tumefaciens b) plasmide Ti privato del T-DNA, necessario per fornire i geni vir (plasmide helper)

13 Marcatori selezionabili Alternative ai marcatori per la resistenza ad anibiotici ed erbicidi Utilizzo del sistema Cre/loxP per eliminare il marcatore di selezione Utilizzo di marcatori innocui, come il gene mana di E.coli che codifica per la mannosio fosfato isomerasi e conferisce alle cellule vegetali trasformate la capacità di utilizzare il mannosio come unica fonte di carbonio

14 Espressione di geni esogeni in piante Promotori forti costitutivi. I più utilizzati sono: a) nelle dicotiledoni, i promotori dei geni per la sintesi delle opine (nos e ocs) e il promotore dell RNA 35S del virus del mosaico del cavolfiore; b) nelle monocotiledoni, i promotori dei geni vegetali actina-1 di riso e ubiquitina-1 di mais. Promotori inducibili Promotori tessuto-specifici Enhancers Segnali di poliadenilazione Segnali di terminazione della trascrizione Segnali per la traduzione Segnali di targeting

15 Trasformazione dei dischi fogliari

16 Agrobacterium e le monocotiledoni Nelle dicotiledoni l integrazione del T-DNA è probabilmente favorita dal fatto che le ferite inducono divisione cellulare e conseguente sintesi di DNA. Nelle monocotiledoni le lesioni inducono, invece, lignificazione, pertanto risultano più refrattarie all integrazione del T-DNA. E possibile comunque trasformare le monocotiledoni con A. tumefaciens utilizzando due accorgimenti: 1. l impiego di cellule proliferanti, come embrioni e meristemi 2. l aggiunta di acetosiringone

17 Trasferimento diretto: produzione di protoplasti 1. Trattamento con pectinasi e cellulasi 2. Introduzione del DNA con agenti chimici (PEG, liposomi) o con elettroporazione 3. Trasferimento dei protoplasti in terreni selettivi 4. I protoplasti trasformati ricostruiscono la parete cellulare in 5-10 giorni. 5. Formazione del callo 6. Rigenerazione della pianta Si può applicare solo ai protoplasti delle cellule di piante che si prestano a essere rigenerati in piante vitali ( in genere le dicotiledoni)

18 Trasferimento diretto: Gene gun Il DNA viene precipitato con CaCl 2 su microparticelle di oro o tungsteno dal diametro di 1-4 µm. Le particelle vengono quindi sparate con gas pressurizzato alla velocità di 250m/s contro le cellule vegetali CARATTERISTICHE DEL METODO Il DNA si integra nel genoma in maniera casuale (trasformazione stabile) Utilizzabile con un gran numero di specie vegetali e con tutti i tipi di colture vegetali (callo, cellule in sospensione, vari tessuti vegetali)

19 Trasferimento in planta Il DNA viene introdotto direttamente nella pianta viva senza la necessità di un passaggio di coltivazione in vitro per ottenere una pianta transgenica fertile. Il DNA viene trasferito mediante Agrobacterium tumefaciens o gene gun in 1. cellule germinali (al momento della fecondazione) 2. embrioni molto precoci CARATTERISTICHE DEL METODO CARATTERISTICHE DEL METODO Scarsa efficienza Poco riproducibile

20 I vantaggi Trasformazione dei cloroplasti L espressione del transgene raggiunge livelli 50 volte maggiori rispetto a quelli ottenibili con la trasformazione del DNA nucleare E un metodo naturale dal momento che il transgene non viene trasmesso al polline e pertanto non può essere propagato mediante gli incroci

21 Trasformazione dei cloroplasti La metodica Gene gun Il DNA si integra nel DNA dei cloroplasti per ricombinazione omologa I vettori contengono 1. regioni di omologia (~ 400bp ciascuna) con il genoma del cloroplasto 2. promotori e segnali di terminazione della trascrizione specifici dei cloroplasti 3. Marcatori di selezione cloroplasto-specifici: aad (ammino-glicoside adeniltransferasi), che conferisce resistenza alla streptomicina e alla spectinomicina

22 Selezione dei cloroplasti transgenici omogenei Si applica una forte pressione selettiva, utilizzando alte dosi di antibiotico per 3-4 generazioni, per ottenere piante con una popolazione omogenea di cloroplasti

23 Caratteristiche Virus vegetali I genomi virali isolati sono infettivi Progenie virale numerosa: alti livelli di espressione delle proteine ricombinanti Le infezioni virali sono spesso sistematiche: l infezione virale si diffonde rapidamente all intera pianta Il genoma virale non si integra nel genoma della cellula ospite. Vantaggi: 1) nessun effetto di posizione; 2) controllo nella diffusione del transgene. Svantaggi: non si possono ottenere linee transgeniche

24 Virus a DNA Il virus del Mosaico del cavolfiore Vantaggio I promotori delle due unità trascrizionali (RNA 35S ed RNA 19S) sono molto forti, permettendo alti livelli di espressione della proteina ricombinante. Il genoma è costituito da una molecola di DNA circolare di 8 kbp contenente 8 geni di cui due (i geni II e VIII) non sono essenziali per la replicazione Svantaggi La dimensione massima di DNA esogeno da poter clonare è di 1 kb a causa del limite di impaccamento del genoma imposto dal capside. Il virus può infettare un numero limitato di specie vegetali.

25 Virus a RNA Il virus del Mosaico del tabacco Vantaggio Non ci sono limiti imposti dal capside virale, essendo virus filamentosi. Pertanto il transgene viene aggiunto al genoma selvatico. Il genoma virale è costituito da una singola molecola di RNA di 6.5 kbp Svantaggio Fenomeni di ricombinazione omologa possono causare delezione del transgene. Procedura: isolamento di cloni di cdna corrispondenti all intero genoma del virus, clonaggio del gene esogeno, trascrizione in vitro del cdna in RNA con la RNA polimerasi per la produzione di un genoma ricombinante a RNA

26 APPLICAZIONI DELLE PIANTE TRANSGENICHE

27 Perché creare piante transgeniche Per la produzione di bioreattori: Anticorpi Farmaci Per migliorare le caratteristiche agronomiche: Resistenza a erbicidi Resistenza a patogeni (virus, insetti, funghi, batteri) Per modificare le caratteristiche produttive: Per modificare le caratteristiche produttive: Maturazione ritardata Miglioramento del valore nutritivo (amido, oli, vitamine) Miglioramento del sapore e dell aspetto dei frutti Miglioramento della pigmentazione dei fiori

28 Le piante come bioreattori Alcune proteine ricombinanti umane con valore terapeutico prodotte in piante Vaccini ricombinanti prodotti nelle piante

29 Resistenza agli erbicidi Biosintesi di aa fotosintesi Meccanismo di azione di erbicidi e modifiche apportate alle piante per renderle resistenti alla loro azione

30 Resistenza agli erbicidi: il glifosato Il glifosato è un erbicida non selettivo che non causa danni all ambiente poiché nel suolo viene rapidamente degradato in composti non tossici. E un inibitore della 5-enolpiruvilscichimato-3-fosfato (EPSP) sintasi, enzima chiave della via biosintetica degli amminoacidi aromatici nei batteri e nelle piante. Piante resistenti al glifosato vengono ottenute attraverso due approcci sperimentali: 1. la proteina bersaglio dell erbicida (EPSP Struttura del glifosato sintasi) viene sovra-espressa 2. viene prodotta una versione mutata della proteina EPSP sintasi che conserva la sua attività catalitica, ma ha una ridotta affinità per l erbicida. RISCHI Il transgene che conferisce resistenza all erbicida può essere trasmesso orizzontalmente alle specie infestanti, creando nuovi ceppi di super-erbacce.

31 Resistenza ai patogeni Resistenza ai virus. Una pianta infettata da un particolare ceppo virale è resistente alla sovrainfezione di un secondo ceppo, correlato al primo. Sono state create piante di tabacco transgeniche che esprimono la proteina di rivestimento del virus del mosaico del tabacco per proteggere la pianta dall infezione da parte del virus stesso. Resistenza ai funghi. Sono state create piante transgeniche che esprimono proteine antifungine. Piante di tabacco che esprimono il gene della chitinasi del fagiolo sono resistenti al fungo patogeno Rhizoctonia solani. La chitinasi idrolizza la chitina, un polimero della parete cellulare di molti funghi. Resistenza agli insetti. Resistenza agli insetti. Numerose specie di piante da raccolto sono state geneticamente modificate per esprimere il gene cry1ac e cryab del batterio Bacillus thuringiensis, che codificano tossine per insetti.

32 Modifiche delle caratteristiche produttive Maturazione ritardata Miglioramento del valore nutritivo (amido, oli, vitamine) Miglioramento del sapore e dell aspetto dei frutti Miglioramento della pigmentazione dei fiori MATURAZIONE RITARDATA. MATURAZIONE RITARDATA. Dal 1994 sono in commercio pomodori transgenici in cui il transgene codifica l RNA antisenso per l enzima poligalacturonasi, coinvolto nel controllo della rottura progressiva dell acido poligalacturonico, un componente della parete cellulare del pericarpo della frutta. L azione dell enzima è importante per la graduale maturazione del frutto. Ritardando l azione dell enzima, il frutto matura più lentamente.

33 La tecnologia dei semi terminatori