MORFINA urinaria in Fluorimetria Cod. Z Metodo di conferma in HPLC

Transcript

1 MORFINA urinaria in Fluorimetria Cod. Z Metodo di conferma in HPLC INTRODUZIONE L Eroina è un alcaloide con una lunga storia di uso ed abuso. La sua determinazione di screening nei liquidi biologici (soprattutto in urina) viene generalmente effettuata usando tecniche immunometriche con l ausilio di anticorpi monoclonali e successiva marcatura con vari reagenti. Poiché tali tecniche non possono escludere falsi positivi, le positività allo screening devono essere confermate con tecnica alternativa, generalmente con tecnica cromatografica sia Gassosa (GC) che Liquida (LC) entrambe accoppiate con detector specifici e selettivi (UV, Fluorescenza, MS). Il presente metodo consente di determinare la Morfina urinaria (il maggiore metabolita della Eroina) previa estrazione SPE e lettura in Fluorimetria. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N Giugno 9

2 CARATTERISTICHE DEL KIT Principio del metodo : Il presente metodo consente di determinare la Morfina urinaria (il maggiore metabolita dell Eroina) previa estrazione SPE e lettura in Fluorimetria. Recupero del Metodo : % Sensibilità del Metodo : <, ng/ml Valore di cut-off: Contenuto della Confezione : ng/ml Rif. Provvedimento /9/ Conferenza Stato-Regioni-Province Autonome di Trento e Bolzano Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili anni a C. Reagente A Enzima di idrolisi, x ml Da ricostituire con 9, ml di Reagente B. Quando ricostituito, l enzima è stabile anno a C. Reagente B Soluzione Tampone per idrolisi, x ml Reagente C Soluzione Condizionamento e Lavaggio, x ml Reagente D Soluzione Condizionamento, x ml Reagente E Soluzione Tampone, x ml Reagente F Soluzione Lavaggio, x ml Reagente G Soluzione Lavaggio, x ml Reagente H Soluzione Eluente, x ml Reagente I Soluzione Stabilizzante, x ml Reagente L Urina purificata Test, x, ml Reagente N Calibratore liofilo urinario, x ml Reagente M Fase Mobile, x ml Colonne di Clean-up, pz Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da µl Detector Fluorimetrico λ EX = nm - λ EM = nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore Computer gestionale Modalità di prelievo urinario : Prelevare ml urina Fase pre-analitica : Stabile per circa mesi a C

3 PROCEDURA PREANALITICA: In una provetta pipettare : µl di H O di grado HPLC µl di Reagente L Urina Purificata Test NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare µl di questa soluzione sul sistema cromatografico per identificare il tempo di ritenzione della Morfina che deve essere simile a quello riportato in fig.. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PROCEDURA ANALITICA: FASE : Ricostituzione dell enzima Aggiungere al Reagente A enzima di idrolisi (contenente ml) 9 ml di Reagente B soluzione tampone per idrolisi. Agitare per inversione FASE : Idrolisi enzimatica dei campioni In provette di plastica da ml idonee dispensare in sequenza. Calibratore Campione Controlli Reagente N Calibratore liofilo urinario, ml Campione, ml Controlli, ml Reagente A Enzima ricostituito µl µl µl Controllare che il ph sia, Eventualmente correggerlo Al vortex per secondi FASE : Porre in stufa a C per ore. FASE : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna, ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento e Lavaggio Scartare l eluato Versare in colonna ml di Reagente D Soluzione di Condizionamento Eseguire questa fase lentamente Scartare l eluato

4 FASE : Preparazione del Campione Dispensare in provetta : Calibratore Campione Controlli Reagente N Calibratore µl Campione idrolizzato µl Controlli µl Reagente E Sol. Tampone µl µl µl Agitare al Vortex FASE : Versare tutti i campioni ed il Calibratore precedentemente preparati nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di ml/ minuto. FASE : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con ml di Reagente F Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato Lavare con ml di Reagente G Soluzione di Lavaggio Scartare l eluato Lavare con ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento e Lavaggio Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE : Eluizione Eluire con µl di Reagente H Soluzione di Eluizione Raccogliere l eluato ed agitare al vortex FASE 9 : Prelevare µl di eluato e aggiungere µl di Reagente I Sol. Stabilizzante Agitare accuratamente al Vortex INIEZIONE : Iniettare µl nel cromatografo HPLC ed attendere la stampa del cromatogramma.

5 REAGENTE L: URINA PURIFICATA TEST MORFINA urinaria - Avvertenze Morfina circa. ng/ml REAGENTE N : CALIBRATORE LIOFILO URINARIO MORFINA Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema HPLC. Aggiungere esattamente ml di H O di grado HPLC e agitare delicatamente per min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili mesi se conservati a C. Una volta ricostituiti giorni se conservati a C e mese a C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : x ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. ng /ml PARAMETRI DEL DETECTOR FLUORIMETRICO Varian λ EX λ EM SENSIBILITA' STRUMENTALE TEMPO DI INTEGRAZIONE nm nm - MEDIUM secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase PURSUIT C, mm x mm, µm, è tassativo l uso della Guard Column Cartridge Holder/CARTUCCIA PRECOLONNA, cod. ZUCC e dei PREFILTRI per CARTUCCIA PRECOLONNA ( x pz.) cod. ZUCC. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase PURSUIT C, mm x mm, µm. Disconnettere il detector e far passare ml di una soluzione di H O : Metanolo ( : v/v ) e successivamente ml di H O per HPLC, al flusso di, ml / minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di, ml / minuto e scaricare i primi ml. Al termine, iniettare il test chimico e verificare la congruità della separazione. NON è possibile effettuare analisi a ricircolo di fase. Il segnale che la fase mobile deve essere cambiata è dato dal significativo innalzamento del rumore di fondo del detector Fluorimetrico. Se la T Amb del Laboratorio è > C si consiglia di conservate a - C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare ml di H O e scaricare. Flussare una soluzione di H O : Metanolo ( : v/v ) per minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare ml di H O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP µl Flusso di lavoro consigliato ml / minuto Pressione corrispondente Circa bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 9 / 9 / 9 ATTENUAZIONE o PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE

6 ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z Calibratore multiparametrico per Droghe d abuso x ml Z Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello x ml Z Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livello x ml Z9 Controllo multiparametrico per Droghe d abuso Livelli e x x ml ZAX Colonna Analitica Pursuit XRs C ( x,mm - u) PZ ZUCC Guard Column Cartridge Holder / Cartuccia Precolonna PZ ZUCC Prefiltri per cartuccia Precolonna x PZ

7 Morfina urinaria (Cromatogrammi di riferimento) mv TEST.DATA mv cal9.data morfina morfina RT[min] RT[min] 9 9 Fig. R.T.. Urina Purificata Test MORFINA Fig. Calibratore urinario R.T.. MORFINA ng/ml

8 Morfina urinaria (Cromatogrammi di riferimento) mv urina+.data mv cal.data morfina morfina RT[min] RT[min] 9 9 Fig. Controllo urinario R.T..9 MORFINA ng/ml Fig. Controllo urinario R.T.. MORFINA ng/ml