OPPIACEI urinari in GC-MS Cod. GC45010 (Morfina, Diidrocodeina, Codeina, Etilmorfina, 6-Monoacetilmorfina) Metodo di conferma in GC-MS

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1 PPIACEI urinari in GC-MS Cod. GC451 (Morfina, Diidrocodeina, Codeina, Etilmorfina, 6-Monoacetilmorfina) Metodo di conferma in GC-MS INTRDUZINE L eroina (diacetilmorfina) è una sostanza d abuso semisintetica ottenuta dalla morfina, uno dei principali alcaloidi dell oppio, per reazione con l anidride acetica. All interno dell organismo, l eroina viene rapidamente idrolizzata a 6-monoacetilmorfina e quindi a morfina. Successivamente quest ultima viene coniugata con acido glucoronico in posizione 3 e 6 della molecola formando morfina 3 e 6 glucoronide. Questi ultimi due metaboliti vengono escreti nelle urine insieme ad una piccola percentuale di morfina libera. E possibile anche ritrovare minime quantità di codeina presente insieme alla morfina nell oppio ed acetilcodeina che si ottiene per acetilazione della codeina durante la preparazione dell eroina. Le metodiche di screening misurano, attraverso una reazione antigene-anticorpo la classe di sostanze degli oppiacei. Qualora l analisi di screening risulti positiva (cut-off > o = a 3) è necessaria un analisi di conferma, generalmente con tecnica cromatografica sia gassosa che liquida entrambe accoppiate con un rivelatore in spettrometria di massa. Il presente metodo consente di determinare la morfina totale urinaria (dopo idrolisi dei glucoronidi), la codeina e la 6-monoacetilmorfina eventualmente presenti in minime quantità, previa estrazione di tali sostanze dalla matrice urinaria in micro colonne di estrazione in fase solida. Il metodo consente anche la determinazione della diidrocodeina e dell etilmorfina. Queste due sostanze oppioidi, che forniscono un risultato positivo alle metodiche di screening per la classe degli oppiacei, sono in realtà i principi attivi di alcune preparazioni farmaceutiche antitussive (es. la diidrocodeina è il principio attivo della paracodina) o si trovano in associazione con altri principi attivi in preparazioni farmaceutiche ad azione analgesicoantipiretica (es. Mindolmerk contiene etilmorfina con propifenazone e caffeina). E importante quindi che il metodo di analisi permetta di identificare anche queste due sostanze e differenziarle dalle altre molecole sopra riportate. EUREKA srl LAB DIVISIN VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Questo prodotto adempie a tutte le esigenze della Direttiva 98/79/CE sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVD). La dichiarazione di conformità CE è disponibile su richiesta. Release N 16 ppiacei urinari in GC/MS Settembre 212 1

2 Principio del metodo : CARATTERISTICHE DEL KIT Il presente metodo consente di determinare la Morfina (il maggiore metabolita dell Eroina), la Diidrocodeina, la Codeina, l Etilmorfina e la 6-Monoacetilmorfina urinarie previa idrolisi delle urine per liberare la morfina dai glucoronidi, estrazione SPE e lettura in GC-MS. Recupero del Metodo : > 95 % Sensibilità del Metodo : < 1, Range dinamico del Metodo : 1 1. Valore di cut-off: Morfina 1 Diidrocodeina 1 Codeina 1 Etilmorfina 1 6-Monoacetilmorfina 1 Contenuto della Confezione (5 test) : Reagente A Enzima di idrolisi, 1 x 1 ml Reagente B Soluzione Tampone per idrolisi, 1 x 15 ml Reagente C Soluzione Condizionamento 1 e Lavaggio 3, 1 x 25 ml Reagente D Soluzione Condizionamento 2, 1 x 1 ml Reagente E Soluzione Tampone, 1 x 1 ml Reagente F Soluzione Lavaggio 1, 1 x 1 ml Reagente G Soluzione Lavaggio 2, 1 x 1 ml Reagente H Soluzione Eluente, 1 x 5 ml Reagente I Soluzione Diluente, 1 x 25 ml Rif. Procedure applicative del procedimento n.99/cu 3 ottobre 27 Tutti i reagenti sono pronti all uso e stabili 3 anni a 2 8 C. Da ricostituire con 9, ml di Reagente B. Quando ricostituito, l enzima è stabile 1 anno a 2 8 C. Reagente N Soluzione Test, 1 x,5 ml Reagente S Soluzione Standard Interno, 1 x 3 µl Reagente P1 Livello 1, 2 x 5 ml Reagente P2 Livello 2, 2 x 5 ml Reagente P3 Livello 3, 2 x 5 ml Reagente P4 Livello 4, 2 x 5 ml Reagente P5 Livello 5, 2 x 5 ml Reagente Q1 6-MAM Livello 1, 2 x 5 ml Reagente Q2 6-MAM Livello 2, 2 x 5 ml Reagente Q3 6-MAM Livello 3, 2 x 5 ml Vedi Avvertenze Da diluire 1:1 in H 2 prima dell uso 2

3 Reagente Q4 6-MAM Livello 4, 2 x 5 ml Reagente Q5 6-MAM Livello 5, 2 x 5 ml Reagente M Soluzione Derivatizzante, 3 x 1 ml (3 ampolle da 1 ml) Vedi Avvertenze Colonne di Clean-up, 5 pz Dotazione strumentale minima richiesta : Dotazione opzionale : Strumento GC-MS Computer gestionale Autocampionatore Modalità di prelievo urinario : Prelevare 1 ml urina Stabile per circa 3 mesi a 2 C Release N 16 ppiacei urinari in GC/MS Settembre 212 3

4 PRCEDURA PREANALITICA: FASE 1 : In una provetta di vetro con tappo in teflon pipettare : 45 µl di Reagente I Sol. Diluente 5 µl di Reagente N Soluzione Test Al vortex per 2 secondi FASE 2 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 4 C) FASE 3 : Riprendere con 5 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante FASE 4: Porre in stufa a 7 C per 2 minuti Al vortex per 2 secondi Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 5 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume NTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare 1 µl di questa soluzione in GC per identificare il tempo di ritenzione degli ppiacei che deve essere simile a quello riportato nelle Fig. sottostanti. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. PRCEDURA ANALITICA: FASE 1 : Ricostituzione dell enzima e diluizione dello Standard Interno Aggiungere al Reagente A enzima di idrolisi (contenente 1 ml) 9 ml di Reagente B Soluzione Tampone per idrolisi. Agitare per inversione N.B: Diluire il Reagente S Sol. Standard interno 1:1 con H 2, preparando il volume sufficiente per coprire i campioni della seduta analitica. N.B.: tale diluizione va preparata fresca ad ogni seduta analitica Release N 16 ppiacei urinari in GC/MS Settembre 212 4

5 FASE 2 : Idrolisi enzimatica dei campioni, fare la Curva di Calibrazione su 5 punti: P1 + Q1 P2 + Q2 P3 + Q3 P4 + Q4 P5 + Q5 Reagente P1 Livello 1 Reagente Q1 6-MAM Livello 1 Reagente P2 Livello 2 Reagente Q2 6-MAM Livello 2 Reagente P3 Livello 3 Reagente Q3 6-MAM Livello 3 Reagente P4 Livello 4 Reagente Q4 6-MAM Livello 4 Reagente P5 Livello 5 Reagente Q5 6-MAM Livello 5 Campione Campione Controlli + Controlli 6-MAM 1, ml Controlli Controlli 6- MAM Reagente S Sol.Std interno (diluito 1:1 in Acqua grado HPLC) 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl Reagente A Enzima ricostituito 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 5

6 Controllare che il ph sia 5, Eventualmente correggerlo Al vortex per 2 secondi N.B. I valori dei Calibratori Morfina, Codeina, Diidrocodeina, Etilmorfina e 6-MAM mixati insieme avranno come concentrazione la META di quella riportata nella tabella delle Avvertenze!!! FASE 3 : Porre in stufa a 6 C per 3 ore. FASE 4 : Condizionamento delle colonne di Clean-up Versare in colonna 1,5 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 1 e Lavaggio 3 Scartare l eluato Versare in colonna 2 ml di Reagente D Soluzione di Condizionamento 2 Scartare l eluato FASE 5 : Preparazione del Campione Dispensare in provetta : idrolizzato Livello 1 idrolizzato Livello 1 idrolizzato Livello 2 idrolizzato Livello 3 idrolizzato Livello 4 idrolizzato Livello 5 Campione idrolizzato Controlli idrolizzati Reagente E Sol. Tampone 12 µl idrolizzato Livello 2 12 µl idrolizzato Livello 3 12 µl 6 idrolizzato Livello 4 12 µl idrolizzato Livello 5 12 µl Campione 12 µl Controlli 12 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl 2 µl Agitare al Vortex FASE 6 : Versare tutto il campione ed il precedentemente preparati nelle colonne di Clean-up e scaricare ad un flusso di 1 ml/ minuto (goccia a goccia) anche con l ausilio di un vuoto moderato. FASE 7 : Lavaggio delle colonne di Clean-up: Lavare con 2 ml di Reagente F Soluzione di Lavaggio 1 Scartare l eluato Lavare con 2 ml di Reagente G Soluzione di Lavaggio 2 Scartare l eluato Lavare con 2 ml di Reagente C Soluzione di Condizionamento 1 e Lavaggio 3 Scartare l eluato e portare a secco con un leggero flusso d aria FASE 8 : Eluizione rigorosamente in provette di vetro con tappo in pyrex Eluire con 1 ml di Reagente H Soluzione di Eluizione Raccogliere l eluato in provette di vetro ed agitare al vortex Release N 16 ppiacei urinari in GC/MS Settembre 212

7 FASE 9 : Portare a secco l eluato con l ausilio di un flusso elio o azoto (in questo step la Temperatura di lavoro deve essere < 4 C) FASE 1 : Riprendere con 5 µl di Reagente M - Soluzione Derivatizzante Al vortex per 2 secondi FASE 11: Porre in stufa a 7 C per 2 minuti Raffreddare a Temperatura ambiente FASE 12 : Trasferire tutto il campione in vials con riduttore di volume INIEZINE : Iniettare 1 µl della soluzione nel GC Release N 16 ppiacei urinari in GC/MS Settembre 212 7

8 PPIACEI urinari - Avvertenze REAGENTE N: SLUZINE TEST Morfina Diidrocodeina Codeina Etilmorfina 6-Monoacetilmorfina circa 1. circa 1. circa 1. circa 1. circa 1. REAGENTE P1-P2-P3-P4-P5 : CALIBRATRI LIFILI URINARI Lot.3 Morfina Diidrocodeina Codeina Etilmorfina Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 di grado HPLC e agitare delicatamente per 2 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 2 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 2 x 5 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. N.B.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente. Liv. 1 Liv ,4 114,7 123,3 124,2 Liv ,6 217,8 226,8 217, Liv. 4 46,5 416,9 417,1 417,1 Liv ,7 113,3 997,9 179,9 REAGENTE Q1-Q2-Q3-Q4-Q5 : CALIBRATRI LIFILI URINARI 6-MAM Lot.4 Liv. 1 Liv. 2 Liv. 3 Liv. 4 Liv. 5 6-Monoacetilmorfina 9,4 172,8 338,3 777, Modalità d uso e Ricostituzione: i Calibratori devono essere usati per calibrare il sistema GC. Aggiungere esattamente 5 ml di H 2 di grado HPLC e agitare delicatamente per 2 min. fino a quando tutto il materiale non è dissolto. Prima del campionamento rimescolare gentilmente per assicurarne l omogeneità. Conservazione e stabilità: i Calibratori sono stabili 36 mesi se conservati a 2 8 C. Una volta ricostituiti 7 giorni se conservati a 2 8 C e 1 mese a 2 C. Non usarli dopo la data di scadenza. Confezionamento : 2 x 5 x 5 ml Precauzioni: questo calibratore in matrice umana deve essere trattato con cura e considerato come potenzialmente infettivo. N.B.: una volta ricostituiti i calibratori vanno stoccati separatamente. REAGENTE M: SLUZINE DERIVATIZZANTE Una volta aperta un ampolla trasferire tutto il contenuto, 1 ml, in una vial di vetro. Chiudere bene il tappo e conservare a 2-8 C. 8

9 SETTAGGI DEL GAS-CRMATGRAF : Colonna VF-5ms 3 m x,25 mm,,25 µm (condizionata) Temperatura iniettore 28 C Rapporto di Splittaggio Inizio: N split 2 min: FF 1 min: N split 1 3 min: N split 2 Temperatura 12 C x 3,25 minuti + 2 C/min fino a 25 C x 1 minuto + 4 C/min fino a 3 C x 3 minuti (corsa 15 minuti) Gas Elio 1 ml/min SETTAGGI DETECTR DI MASSA (4) : Range di Massa 6 5 Temperatura della Massa: 18 C; Temperatura Transfer Line: 27 C; Temperatura Manifold: 8 C Filamento on: 5 minuti CNDIZINAMENT DELLA CLNNA VF-5 MS E DELLA SIRINGA Lavare la siringa prima dell iniezione con ACETNE. Per la colonna seguire le prescrizioni del costruttore. Non condizionare la (le) colonna/e se attaccata al Detector di Massa. PULIZIA DELLA CLNNA Disconnettere il detector. Tenerla alla massima temperatura per il tempo consigliato. ( Vedi istruzioni del costruttore ) PARAMETRI CMPUTER GESTINALE SECND LE SPECIFICHE DEL SFTWARE GESTINALE ACCESSRI E CNSUMABILI CDICE DESCRIZINE CNFEZINE CC4516 per ppiacei urinari 5 x 2 x 5 ml CC4517 Controllo per ppiacei urinari Livello 1 6 x 5 ml CC4518 Controllo per ppiacei urinari Livello 2 6 x 5 ml CC4519 Controllo per ppiacei urinari Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml CC45116 per 6-MAM urinaria 5 x 2 x 5 ml CC4817 Controllo per EDDP, 6-MAM e Cocaina urinari Livello 1 6 x 5 ml CC4818 Controllo per EDDP, 6-MAM e Cocaina urinari Livello 2 6 x 5 ml CC4819 Controllo per EDDP, 6-MAM e Cocaina urinari Livelli 1 e 2 2 x 6 x 5 ml S2957U Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite 1 x 1 Pz S24717 Riduttori di volume per vials da 2 ml 1 x 1 Pz 9

10 ppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) kcounts 6 5 CDEINA-TMS 19 c2 15ng-2_ sms Ions: 371. Filtered 1% BP 371. (999=1%) 8 in EUREKA CDEINA-TMS CDEINA-TMS m in 75% kcounts 6 5 CDEINA-TMS 21 c3 21ng-2_ sms Ions: 371. Filtered kcounts CDEINA-TMS 22 c4 42ng-2_ sms Ions: 371. Filtered CDEINA-TMS min CDEINA-TMS m in 5% 25% % minutes m/z Fig. 1 : Campione urinario Codeina Fig. 2 : Spettro di Massa Codeina R.T CDEINA INI MLECLARI:

11 ppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) Dihydrocodeine TMS derivative 19 c2 15ng-2_ sms Ions: Filtered Dihydrocodeine TM S derivative m in 7% 6% BP 373. (999=1%) in MAINLIB N Dihydrocodeine TMS derivative C21H31N3Si, MW Dihydrocodeine TMS derivative 21 c3 21ng-2_ sms Ions: Filtered Dihydrocodeine TM S derivative m in 5% 4% 3% Si Dihydrocodeine TMS derivative 22 c4 42ng-2_ sms Ions: Filtered Dihydrocodeine TM S derivat min 2% 1% minutes % m/z Fig. 3 : Campione urinario Diidrocodeina Fig. 4 : Spettro di Massa Diidrocodeina R.T DIIDRCDEINA INI MLECLARI:

12 1..75 ETILMRFINA-TMS 19 c2 15ng-2_ sms Ions: 385. Filtered ppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) 1% BP 73. (999=1%) 17 in EUREKA ETILMRFINA-TMS ETILMRFINA-TMS 21 c3 21ng-2_ sms Ions: 385. Filtered ETILMRFINA-TMS m in 75% ETILMRFINA-TMS 22 c4 42ng-2_ sms Ions: 385. Filtered E T IL M R F IN A -T M S m in ETILM RFINA-TM S m in 5% 25% % minutes m/z Fig. 5 : Campione urinario Etilmorfina Fig. 6 : Spettro di Massa Etilmorfina R.T ETILMRFINA INI MLECLARI:

13 ppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) kcounts 6 5 MRFINA-TMS 19 c2 15ng-2_ sms Ions: 429. Filtered 1% BP 429. (999=1%) 4 in EUREKA MRFINA-TMS MRFINA-TMS min 75% kcounts 6 MRFINA-TMS 21 c3 21ng-2_ sms Ions: 429. Filtered kcounts MRFINA-TMS 22 c4 42ng-2_ sms Ions: 429. Filtered MRFINA-TMS min MRFINA-TMS m in 5% 25% % minutes m/z Fig. 7 : Campione urinario Morfina Fig. 8 : Spettro di Massa Morfina R.T MRFINA INI MLECLARI:

14 ppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) 6-Acetylmorphine, 3--trimethylsilyl- 11 c2 15ng-2.sms Ions: Filtered Acetylmorphine, 3--trimethylsilyl- 16 c3 21ng-3.sms Ions: Filtered Acetylm orphine, 3--trim ethylsilyl m in 6-Acetylm orphine, 3--trim ethylsil m in BP 399. (999=1%) in MAINLIB 1% 75% 5% Si 6-Acetylmorphine, 3--trimethylsilyl- C22H29N4Si, MW N Acetylmorphine, 3--trimethylsilyl- 17 c4 42ng-3.sms Ions: Filtered Acetylm orphine, m in 25% % minutes m/z Fig. 9 : Campione urinario 6-Monoacetilmorfina Fig. 1 : Spettro di Massa 6-Monoacetilmorfina R.T MNACETILMRFINA INI MLECLARI:

15 ppiacei urinari (Cromatogrammi/Spettri di riferimento GC-MS) Nalorphine, o,o'-bis(trimethylsilyl)- 11 c2 15ng-2.sms Ions: Filtered N alorphine, o,o'-bis (trim eth m in 1% BP 455. (999=1%) in MAINLIB Si Nalorphine, o,o'-bis(trimethylsilyl)- C25H39N3Si2, MW Nalorphine, o,o'-bis(trimethylsilyl)- 16 c3 21ng-3.sms Ions: Filtered N alorphine, o,o'-bis(trim eth m in 75% 5% Si N Nalorphine, o,o'-bis(trimethylsilyl)- 17 c4 42ng-3.sms Ions: Filtered Nalorphine, o,o'-bis(trim m in 25% % minutes m/z Fig. 11 : Campioni urinari con Standard Interno Fig. 12 : Spettro di Massa Standard Interno R.T STANDARD INTERN INI MLECLARI: