Watson Alberts et al., L ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

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3 Watson Eventi della fase S: coesione fra i cromatidi fratelli mediante le molecole di coesina che girano intorno al DNA appena sintetizzato

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5 Alberts et al., L ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. CoxCopyright 2005 Coesine, condensine e separasi nel ciclo cellulare G1 = i cromosomi si caricano di coesine che terranno uniti i cromatidi fratelli durante la replicazione Inizio mitosi si legano le condensine che mantengono i cromatidi in uno stato condensato Anafase: la separasi rimuove i collegamenti di coesina e si staccano le molecole di condensine

6 Sintesi del DNA La doppia elica del DNA agisce da stampo per la propria duplicazione. Ciascun filamento serve da stampo per specificare la sequenza dei nucleotidi nel suo filamento complementare

7 Nnn nnn Nnn

8 Replicazione semiconservativa ordinata sequenziale bidirezionale semidiscontinua alta fedeltà di replicazione La replicazione del DNA inizia a partire da origine fisse (sequenze casuali) e richiede la sintesi contemporanea di due filamenti figli con lo svolgimento del duplex parentale, ciascuno complementare nella sequenza e antiparallelo ad uno dei filamenti parentali Van Holde

9 Natura semiconservativa della replicazione del DNA In un ciclo di replicazione ciascuno dei due filamenti di DNA viene usato come stampo per la formazione di un filamento complementare di DNA

10 Replicazione bidirezionale del DNA nei procarioti (una sola origine di replicazione) e negli eucarioti (molte origini) Si forma una bolla (2 forcelle) Campbell Complessi proteici nelle origini di replicazione

11 Unità di replicazione = replicone; un cromosoma ne può contenere migliaia di repliconi

12 Attività elicasica

13 Proteine che legano il DNA a singolo filamento (proteine SSB). Legame cooperativo fra le varie proteine che raddrizza lo stampo facilitando il processo di polimerizzazione Alberts

14 Replicazione del DNA dei procarioti. Una versione semplificata della successione di eventi che portano all inizio della replicazione del DNA nei procarioti con indicate alcune delle principali proteine coinvolte.

15 Reazione fondamentale della sintesi del DNA Aggiunta di un deossiribonuceotide 3P all estremità 3 da una catena polinucleotidica (filamento primer) Il nuovo filamento quindi polimerizza in direzione 5 3 L appaiamento delle basi fra un deossiribonucleotide trifosfato (substrati attivati) in arrivo, il filamento esistente di DNA (filamento stampo) guida la formazione del nuovo filamento Sono necessari anche ioni Mg +2 che riducono l'affinità del 3'-OH per il suo idrogeno, generando un 3'-O- necessario per l'attacco nucleofilico del fosfato in α del nucleotide che deve essere polimerizzato Rilascio di pirofosfato e successiva idrolisi a due molecole di fosfato inorganico che liberano energia favorendo la reazione di polimerizzazione

17 Reazione di polimerizzazione Aggiunta di un nucleotide alla volta ad una catena di DNA crescente

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19 La DNA polimerasi non è capace di catalizzare la sintesi de novo, ma richiede la presenza di un innesco (primer) Primer = corto filamento di RNA che si appaia al DNA stampo e dal quale si estende la catena polinucleotidica in crescita nelle fasi iniziali della replicazione Nucleoside trifosfato Primer (innesco) Filamento stampo a singola catena

20 Substrati necessari e meccanismo di sintesi del DNA da parte di unadna polimerasi. (A) È indicata la struttura generale di un deossiribonucleoside trifosfato: la posizione dei tre fosfati relativamente alla molecola dello zucchero è indicata con le lettere dell alfabeto greco. (B) È indicata la struttura del complesso innesco-stampo. L innesco deve avere un terminale OH libero all estremità 3'. Si forma, quindi, una regione a doppio filamento tra lo stampo e l innesco, mentre la regione dello stampo che verrà copiata dalla DNA polimerasi mediante l allungamento dell estremità 3'OH dell innesco è a singolo filamento. Nel caso della replicazione del DNA in vivo, l innesco fisiologico è normalmente rappresentato da una corta molecola di RNA (vedi testo). (C) L allungamento dell innesco e la successiva sintesi di tutto il DNA prevedono l attacco nucleofilo del fosfato α del dntp che deve essere aggiunto all estremità 3'OH. Ciò determina l allungamento di un nucleotide della catena nascente di DNA e la liberazione di una molecola di pirofosfato che, essendo rapidamente degradata da una pirofosfatasi, fornisce gran parte dell energia necessaria per la biosintesi del DNA. Genomi

21 Ruolo degli ioni metallici nella catalisi della DNA polimerasi Il sito attivo dell enzima contiene 2 ioni metallici Mg ++ in particolare da residui di aspartico. Un Mg ++ deprotona il gruppo 3 OH, ne diminuisce il pka per formare il nucleofilo 3 O - facilitando l attacco al Pa, l altro lega il dntp in arrivo, interagisce con le cariche negative degli ossigeni, e facilita l uscita del pirofosfato

22 Correzione esonucleasica da parte della DNA polimerasi I e III durante la replicazione L attività esonucleasica 3-5 delle Pol fa parte della funzione di proofreading (lettura delle bozze): i nucleotidi (uno alla volta) erroneamente appaiati sono rimossi dal polinucletide neosintetizzato Alberts

23 La reazione di replicazione del DNA è catalizzata dalla DNA polimerasi III La DNA pol. di E.coli assomiglia ad una mano destra in cui il palmo, le dita e il pollice afferrano il DNA

24 capacità di sintetizzare una "stringa di nucleotidi" prima che l'enzima si dissoci, capacità della DNA-polimerasi di rimanere attaccata allo stampo.

25 Struttura della forca replicativa

26 1 2 3

28 Sostituzione DNA polimerasi durante la replicazione del DNA negli EUCARIOTI Switch delle polimerasi Sliding clamp = pinza scorrevole, aumenta la processività della DNA pol

29 Modello semidiscontinuo della replicazione DNA Poiché entrambi i filamenti sono sintetizzati simultaneamente da una DNA polimerasi multimerica in corrispondenza della forcella, il filamento parentale 5-3 deve avvolgersi così che la DNA polimerasi che lo replica possa muoversi in direzione 3-5 del filamento stampo Campbell

30 Citologia 27 - Replicazione del DNA YouTube 7 min La duplicazione del DNA HD YouTube o9pfo Citologia - Lezione 17: Duplicazione del DNA - YouTube 7 min Alberts et al., L ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE Genomi EdiSES DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2005

31 Caratteristiche generali di una forcella di replicazione procarioti Campbell

32 Forcella di replicazione attiva Alberts

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34 Procarioti DNA pol III Oloenzima = complesso multiproteico con proteine con attività catalitica e altre che regolano la funzione 3 copie di DNA Polimerasi «core» e una del caricatore dello sliding clamp formato da 5 proteine Amaldi Oloenzima formato da diverse subunità Due complessi catalitici della DNA Polimerasi III Watson

35 Assemblaggio della DNA Polimerasi III sul DNA Questo modello porta il filamento ritardato ad essere parallelo a quello continuo

36 DNA polimerasi batteriche: DNA Pol I DNA Pol III DNA Pol II DNA polimerasi eucariotiche: circa 14 DNA diverse: DNA Pol a, b, d,e DNA Pol per la replicazione del DNA mitocondriale

37 Capranico 3 3 Rimozione inneschi PROCARIOTI

38 Rimozione inneschi EUCARIOTI Capranico

40 Karp

41 Reazione catalizzata dalla DNA ligasi Alberts Saldatura del legame fosfodiestere spezzato. Utilizzo di una molecola di ATP per attivare l estremità 5 a livello del taglio, prima di formare il nuovo legame. Processo energicamente favorevole Alberts

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43 L avanzamento della bolla provoca la formazione di topoisomeri Karp

44 Pearson

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46 1 2 3

47 Problema della replicazione delle estremità nei cromosomi lineari Accorciamento dei telomeri Alberts et al., L ESSENZIALE DI BIOLOGIA MOLECOLARE DELLA CELLULA, Zanichelli editore S.p.A. coxcopyright 2005

48 I genomi lineari delle cellule eucariotiche devono affrontare il problema del completamento della replicazione del filamento ritardato. La rimozione dell innesco dell RNA al 5 lascerebbe una lacuna che non potrebbe essere riempita dalla DNA polimerasi, per l assenza di una estremità di innesco da estendere, quindi il cromosoma si accorcerebbe ad ogni ciclo di replicazione

49 stampo stampo

51 Estensione delle estremità ad opera delle telomerasi cox

52 Meccanismo d azione telomerasi umana Problema della replicazione sui cromosomi lineari Amaldi

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55 I telomeri formano un ansa nella cellula Watson 6 ediz Watson 6 ediz Amaldi

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57 Proteine adiuvanti del riassemblaggio dei nucleosomi (histone chaperons) Alcuni nucleosomi figli contengono solo istoni parentali o solo istoni di nuova sintesi; molti sono ibridi di vecchi e nuovi istoni