STAGE DIPARTIMENTO DI FISICA Biofisica: microscopia confocale e costruzione di nanocapsule

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1 STAGE DIPARTIMENTO DI FISICA Biofisica: microscopia confocale e costruzione di nanocapsule Bocchio Marco (Leonardo da Vinci, Genova) Gadoglia Edoardo (Galileo Ferrarsi, Savona) Zilioli Andrea (Nicoloso, Recco) Al dipartimento di fisica e precisamente nella sezione di biofisica di Genova si stanno sviluppando tecniche di microscopia (confocale e a due fotoni) per l`analisi e l osservazione di nanocapsule, progettate e costruite da un gruppo di ricerca del dipartimento. Il progresso in campo nanotecnologico è stato possibile grazie all introduzione di nuovi metodi di osservazione. Ciò che ha contribuito maggiormente allo sviluppo delle nostre conoscenze in ambito biomedico, è sicuramente il microscopio confocale a scansione, a cui si deve l avvento della terza dimensione nel mondo microscopico. Il grande aiuto portato in ambito biologico da questo tipo di microscopia è strettamente legato alla scoperta del fenomeno della fluorescenza: è infatti possibile marcare con molecole, appunto fluorescenti, particolari strutture biologiche di interesse e seguirne l evoluzione spazio-temporale attraverso il microscopio confocale. Microscopio confocale Un microscopio confocale è formato da diversi elementi: un microscopio ottico tradizionale con obiettivo invertito come quello mostrato in figura; una caratteristica che agevola l intervento sul campione che si sta osservando; un modulo di scansione formato dalla testa confocale, per la scansione del fascio luminoso sul campione; un modulo di eccitazione composto da tre linee laser (488nm, 543nm, 633nm) per l eccitazione delle molecole fluorescenti.

2 Tale microscopio consente di osservare in successione strati (piani xy, così come xz o yz) del campione oggetto di studio ed effettuare il cosiddetto sezionamento ottico. L innovazione sta proprio nella possibilita` di visualizzare ogni singolo strato eliminando le componenti dei luce emessa al di sopra e al di sotto del piano focale in analisi. Muovendosi lungo l asse ottico è possibile variare il piano focale; dall unione di tutte le sezioni è poi possibile ricostruire la struttura tridimensionale del campione. Questo permette di ottenere immagine notevolmente più nitide e con un miglior contrasto segnalerumore; un vantaggio considerevole nei confronti anche dei piu` moderni microscopi elettronici a trasmissione e a scansione consiste nel non essere costretti a sezionare il campione danneggiandone cosi` le eventuali strutture viventi. Come funziona? Tale strumento e` dotato di tre laser di diversa lunghezza d onda (verde, rosso, blu) i quali vengono utilizzati per eccitare le molecole fluorescenti del campione in analisi. L illuminazione del campione avviene attraverso la proiezione di una sorgente luminosa puntiforme nel piano di fuoco dell obiettivo. Le cellule del piano eccitate emettono quindi luce; la raccolta del segnale emesso viene limitata dall introduzione di un disco forato (pinhole) di apertura variabile posto di fronte al detector. La luce proveniente dalle regioni esterne al piano focale viene conseguentemente bloccata, eliminando cosi` il contributo all immagine dai piani sovra e sottostanti, arrivando cosi` ad ottenere un sezionamento ottico dell oggetto osservato. L uso dello strumento e` coadiuvato da un software apposito e programmato dalla casa produttrice; la digitalizzazione del segnale luminoso permette di raccogliere l immagine in tutti i sezionamenti consentendo la creazione di un immagine 3d. Cellule di rene di ratto osservate sulle proiezioni dei tre piani (xy,xz,yz) Costruzione e utilizzo di nanocaspsule Il termine nanocapsula non e` riferito alle dimensioni fisiche degli oggeti realizzati, che possono variare dai 5 ai 10 micrometri, ma dalla possibilita` di controllare a livello nanometrico lo spessore delle capsule con una molteplicita` di circa 1,5-2 nm e la loro permeabilita`. Tali nanocapsule sono sviluppate su un cristallo di carbonato di calcio (ottenuto mediante la reazione tra carbonato di sodio e cloruro di calcio). Vengono utilizzati due differenti polielettroliti (PSS, poli sodium stirene sulfonate e PAH, poli allilanide idrocloride) che presentano carica opposta: in questo modo è possibile costruire degli strati attorno al cristallo che rimangono uniti per

3 semplici forze elettrostatiche formando, così, un guscio dello spessore voluto a secondo del numero di strati inseriti. Osservazione di nanocapsule con misurazione del diametro (valore medio 7 micrometri) Il cristallo all interno della nanocapsula puo` essere rimosso per la realizzazione di una nanocapsula vuota e quindi riempibile e svuotabile grazie al cambiamento di permeabilita`. Siamo in grado di rimuovere il cristallo tramite l aggiunta di acido cloridrico, che puo` essere effettuata direttamente sul microscopio e quindi monitorata nel periodo di reazione. Due immagini di nanocapsule: nella prima si nota la rodamina all esterno delle nanocapsule,nella seconda si può vedere l inserimento della rodamina all interno come conseguenza dell aggiunta di acido cloridrico e del successivo scioglimento dei cristalli Per poter visualizzare lo scioglimento del cristallo si aggiunge al campione rodamina fluorescente. Notiamo quindi che le capsule sono immerse in ambiente fluorescente (colore rosso) ma all interno rileviamo la presenza del cristallo (colore nero) per contrasto, in quanto il cristallo assorbe tutta la

4 radiazione del laser senza emetterne. Aggiungendo pero` acido cloridrico diluito, si puo` osservare il progressivo scioglimento del cristallo e la conseguente penetrazione della rodomina nella nanocapsula. Attraverso il software si può selezionare l area interna di una nanocapsula e monitorare il progressivo inserimento della rodomina all interno e visualizzarlo tramite un grafico. Come si puo` notare vi e` un primo picco nel grafico dovuto allo spostamento delle nanocapsule seguente all inserimento di acido cloridrico, mentre il secondo indica il parametro di diffusione delle pareti della nanocapsula e in parte minore anche dalla concentrazione di acido cloridrico. Legato a questo tipo di microscopio ottico vi e` il problema del photobleaching. Tale fenomeno e` dovuto alla prolungata o eccessiva esposizione a radiazioni luminose delle cellule fluoerescenti e causa un decadimento della fluorescenza che impedisce quindi una successiva osservazione. Il fenomeno del photobleaching in un microscopio confocale è esteso a tutto il volume di eccitazione (doppio cono a partire dal piano focale). Ogni volta che osserviamo un campione con un microscopio confocale necessariamente la fluorescenza diminuisce nel tempo e puo` essere quindi un problema per l osservazione. Si puo` usare pero` questo effetto anche vantaggiosamente. Cellule di rene di ratto nelle quali abbiamo causato il fenomeno del photobleaching

5 E possibile, infatti, far fotodecadere una zona voluta del campione e seguirne le successive dinamiche di ripopolamento: questo porta interessanti informazioni sulla diffusione delle molecole, sulla velocità di processi biologici. In ambito medico le nanocapsule sembrano avere grandi possibilita` di affermarsi per la cura di cellule tumorali. Infatti in via teorica tali strutture hanno la possibilita` di racchiudere nel loro interno farmaci e rilasciarli selettivamente nella zona di interesse. Microscopio a due fotoni Uno dei limiti del microscopio confocale risiede nella decadenza della fluorescenza nel campione dovuta all effetto photobleaching, come spiegato precedentemente. Tale fenomeno si puo` limitare con l uso del microscopio a due fotoni: questo tipo di microscopia permette, infatti, di eccitare un piccolissimo volume al contrario del microscopio confocale che eccita tutto il doppio cono di materia. Questa diminuzione di volume va cercata nel differente processo di eccitazione. Con un microscopio a due fotoni, infatti, le molecole interessate vengono eccitate con due fotoni di energia pari alla metà di quella necessaria per eccitarle con un singolo fotone. I due fotoni, inoltre, devono arrivare sull obiettivo contemporaneamente che in termini fisici significa in un intervallo di tempo di circa s. E` possibile innescare un processo di assorbimento a due fotoni grazie all utilizzo di laser ultapulsati in grado di mandare la luce a pacchetti con un alta densita` fotonica: gli impulsi di tali laser hanno solitamente una durata intorno ai 100 fs ed una ripetizione dell ordibne di 100 MHz Serie1 Serie Tramite l analisi dello spettro si nota che le cellule prese in esame sono di tipo differente in quanto emettono luce di lunghezza d onda differente come evidenziato dal grafico