Permette di monitorare in tempo reale l andamento della reazione ed effettuare una quantizzazione del frammento amplificato

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1 Permette di monitorare in tempo reale l andamento della reazione ed effettuare una quantizzazione del frammento amplificato

2 Lo strumento è composto da:! Un sistema ottico per eccitare il marcatore fluorescente o le sonde e catturare la fluorescenza emessa! Un software per interpretare questo segnale graficamente! Un thermal cycler

3 Svantaggi della PCR convenzionale! Bassa sensibilità! Bassa risoluzione! Discriminazione basata solo sulla dimensione del frammento. Nessuna informazione sulla purezza del prodotto (rischio di contaminazione)! I risultati non sono quantitativi! Il prodotto finale non è direttamente correlato all ammontare ammontare iniziale di DNA

4 Fasi dell amplificazione PCR Durante la fase esponenziale c èc una stretta relazione tra l ammontare l di DNA ed il numero di cicli. Durante una PCR, i reagenti sono limitati dopo pochi cicli. Il numero di copie diventa costante. Solo una parte molto precoce della curva rappresenta la correlazione lineare La Real-time implica che la collezione dei dati e l analisi avviene contemporaneamente al procedere della reazione

5 Real Time PCR :Vantaggi:! C è una relazione quantitativa tra l ammontare l del templato iniziale e l ammontare del prodotto di PCR nella fase esponenziale della reazione di PCR! Alta sensibilità! Alta specificità! L amplificazione può essere monitorata in tempo reale! I prodotti non richiedono processamenti dopo l amplificazione l (basso rischio di contaminazione)! Durata dei cicli ultra-rapida rapida (da 30 minuti a 2 ore)! Richiesta di molto meno templato di un saggio convenzionale! Non è più costosa di una PCR convenzionale

6 Quantizzazione del DNA tramite Real Time PCR!La Real-time PCR monitora la quantità di prodotto amplificato ad ogni ciclo in base alla fluorescenza emessa da uno specifico marcatore!il primo aumento significativo nell ammontare del prodotto di PCR (C T - ciclo soglia) è correlato all ammontare ammontare iniziale del templato

7 Possibili applicazioni della Real Time PCR Quantizzazione relativa: per per determinare le differenze del livello di espressione di acidi nucleici.. Il livello di espressione è comparato con l espressione di un gene di riferimento,, come un gene housekeeping o un RNA ribosomale. Quantizzazione assoluta: per Espressione genica Farmacologia per determinare il numero iniziale di copie o la concentrazione delle molecole di acido nucleico. Richiede la preparazione di curve standard di fluorescenza di RNA o DNA contro una quantità variabile di templato. Quantizzazione di patogeni Controllo di qualità Danni al DNA

8 Real Time PCR detection Richiede l aggiunta l di coloranti fluorescenti o sonde marcate con un fluorocromo alla PCR master mix Il SISTEMA PIU COMUNE: Coloranti intercalanti fluorescenti (come SYBR Green)! Solo la doppia elica di DNA può essere fluorescente! La fluorescenza aumenta solo dopo l amplificazione l PCR (dsdna( de novo synthesis)! PCR master mix (che( contiene il colorante) ) non è fluorescente! I primers non devono emettere fluorescenza (non devono formare dimeri durante l amplificazionel amplificazione)

9 SYBR Green: dsdna Fluorescent dye SYBR Green Denaturazione Ibridazione Taq polymerase Estensione (emissione di fluorescenza)

10 Quando scegliere il SYBR Green!Saggi che non richiedono specificità e/o sensibilità delle sonde!screening generale di trascritti!quando il sistema di PCR è completamente ottimizzato per non avere dimeri o amplificati non specifici!validazione dei dati di array Quando non usare SYBR Green!Discriminazione di alleli!reazioni multiple!amplificazione di trascritti rari!rilevamento di bassi livelli di patogeni

11 Prima di iniziare un esperimento di Real Time: Estrazione e purificazione di acidi nucleici Retro-trascrizionetrascrizione Real view Logarithmic view Threshold! Il software misura per ogni campione il numero di cicli al quale la fluorescenza incrocia la linea arbitraria,, la soglia! Il punto di incontro è il valore Ct! I campioni più diluiti si incroceranno agli ultimi valori di Ct

12 !Per avere una quantizzazione assoluta dobbiamo ottenere una curva standard!il risultato è un grafico lineare!il valore Ct dei nostri campioni sono riportati su una curva standard, per ottenere l ammontare l iniziale di templato.

13 !Per avere una quantizzazione relativa con il SYBR green abbiamo bisogno di un gene di riferimento come!-tubulina!l amplificazione del gene di riferimento e del gene di interesse avvengono simultaneamente, in tubi separati, ognuno in triplicato per ottenere un valore medio statisticamente significativo!ogni reazione può essere seguita separatamente, ad ogni tempo dell amplificazione!ogni campione amplificato è rappresentato da un colore differente

14 !Alla fine della reazione, il software calcola la melting curve per ogni campione, relazionando la riduzione della fluorescenza con l incremento l della temperatura per sapere se i nostri campioni contengono solo il prodotto specifico (Tm è correlata con la dimensione del DNA ed il contenuto di CG) E stato rilevato solo un prodotto E stato amplificato un prodotto non specifico in uno dei campioni