Analisi rapida di 37 FAME con il gascromatografo Agilent 8860
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- Fabrizio Serafini
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1 Nota applicativa Alimenti Analisi rapida di 37 FAME con il gascromatografo Agilent 88 Autore Youjuan Zhang Agilent Technologies (Shanghai) Co. Ltd., Shanghai 131 Cina Abstract Un GC Agilent 88 dotato di un iniettore split/splitless e di un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) è stato utilizzato per analizzare una miscela standard di 37 metilesteri di acidi grassi (FAME) e campioni reali di formulati proteolitici. La presente nota applicativa descrive l analisi di una miscela di 37 FAME, più rapida che con il metodo GB , con una separazione eccellente.
2 Introduzione Gli acidi grassi sono i principali componenti dei grassi neutri, dei fosfolipidi e dei glicolipidi. Gli acidi grassi possono essere suddivisi in tre categorie: saturi, monoinsaturi e polinsaturi. Alcuni acidi grassi, come l'acido linoleico, sono acidi grassi essenziali, cioè non possono essere sintetizzati dall organismo e devono essere ricavati dagli alimenti. Gli acidi grassi omega-3 e omega-6, come l acido arachidonico (ARA), l acido eicosapentaenoico (EPA) e l acido docosaesaenoico (DHA) sono polinsaturi e svolgono un ruolo fondamentale nella nutrizione umana. Si ritiene che gli acidi grassi omega-3 siano coinvolti nella prevenzione di malattie come le cardiopatie o l ipertensione. I grassi svolgono un ruolo molto importante nella nutrizione e nella chimica degli alimenti. L idrolisi e la metilazione sono i metodi usati più comunemente per la determinazione degli acidi grassi; l'esterificazione ne riduce la polarità e facilita la separazione degli isomeri insaturi. L analisi dei metilesteri degli acidi grassi (FAME) è una delle applicazioni più importanti nell analisi degli alimenti. Il metodo GB regolamenta la determinazione di 37 acidi grassi negli alimenti. Questo metodo descrive dettagliatamente i parametri relativi al pretrattamento dei campioni e alla gascromatografia (GC) e raccomanda l uso di una colonna di tipo ciano-polisilossano altamente polare (1 m x,2 mm,,2 µm). Il metodo permette di separare 37 FAME in 82 minuti. Una precedente nota applicativa Agilent mostra che il sistema GC Agilent Intuvo 9 dotato di colonna per GC Agilent J&W DB-FastFAME Intuvo, con elio come gas di trasporto, può risolvere 37 FAME in otto minuti 2. Questa rapida analisi sfrutta la tecnologia Intuvo a riscaldamento diretto, che permette alla colonna di essere riscaldata a 2 C/min. La presente nota applicativa descrive metodi relativamente rapidi con due colonne DB-FastFAME di diversa lunghezza usando il sistema GC 88 con azoto come gas di trasporto. Sono state determinate le RSD dell'area e sono stati quantitativamente analizzati grassi neutri fondamentali come ARA, EPA e DHA. Per dimostrare l applicabilità del metodo, in questa applicazione sono stati analizzati anche campioni di formulati per neonati. Condizioni sperimentali Prodotti chimici e standard La miscela standard di FAME a 37 componenti (codice CDAA MIX-1 ml) e gli standard singoli di C:4n6 (codice CDAA 237M-1 mg), C:n3 (codice CDAA-239M-1 mg) e C22:6n3 (codice CDAA-23228M-1 mg) sono stati acquistati da ANPEL Scientific Instrument Co. Ltd. (Shanghai, Cina). La concentrazione di ciascun componente in miscela era di - mg/ml. I campioni di formulati per neonati sono stati acquistati localmente. Il pretrattamento dei campioni è stato eseguito secondo il metodo GB Strumentazione Le analisi dei FAME sono state effettuate usando un GC 88 dotato di rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID). I campioni sono stati introdotti utilizzando un campionatore automatico per liquidi Agilent 7693A con siringa da µl e una porta di iniezione split/splitless. In Tabella 1 e 2 sono riportati gli strumenti e le condizioni utilizzati. Tabella 1. Condizioni del metodo per la colonna Agilent DB-FastFAME, 3 m,2 mm,,2 µm. Parametro Sistema GC GC/FID 88 Valore Iniettore Split/splitless; 2 C, rapporto di splittaggio 1:1; liner (codice ) Colonna Gas di trasporto Forno FID Iniezione 1 µl DB-FastFAME, 3 m,2 mm,,2 µm (codice G ) Azoto, 12 psi, pressione costante 8 C (, minuti), C/min fino a 16 C (1 minuto), 4 C/min fino a 23 C (4 minuti) 2 C; idrogeno: ml/min; aria: ml/min; gas di make-up (N 2 ): 2 ml/min Tabella 2. Condizioni del metodo per la colonna Agilent DB-FastFAME, m,18 mm,,2 µm. Parametro Sistema GC 88/FID Valore Iniettore Split/splitless; 2 C, rapporto di splittaggio 1:1; liner (codice ) Colonna Gas di trasporto DB-FastFAME, m,18 mm,,2 µm (colonna G ) Azoto, psi, pressione costante Forno 8 C, 3 C/min fino a 194 C (1 minuto), C/min fino a 24 C FID Iniezione 1 µl 2 C; idrogeno: ml/min; aria: ml/min; gas di make-up (N 2 ): 2 ml/min 2
3 Risultati e discussione La Figura 1 mostra un cromatogramma tipico per l analisi della miscela standard di 37 FAME, ottenuto con una colonna DB-FastFAME da 3 m. In alcune applicazioni, i composti cise trans-c18:1, cis- e trans-c18:2, C22:, C:3, C22:6 e possono coeluire causando problemi di identificazione dei picchi. Come mostra la Figura 1, usando queste condizioni tutti e 37 i composti sono stati ben separati con il sistema GC 88, ottenendo picchi simmetrici e affilati e un tempo di analisi ridotto a meno di 24 minuti. Da notare la capacità di separare gli isomericis trans e i componenti EPA e DHA. Questo metodo è molto utile per l analisi quantitativa degli acidi grassi in miscele complesse, specialmente per la determinazione di EPA e DHA in matrici come l olio di pesce. Rispetto a una colonna con d.i. di,18 mm, il maggiore d.i. e il film più spesso di questa colonna da 3 m,2 mm,,2 µm permettono di ottenere una maggiore capacità della colonna e una sua maggiore durata. I formulati proteolitici sono ideali per i neonati con allergie al latte e possono essere distinti in tre tipi in base al grado di idrolisi: formula parzialmente idrolizzata, formula altamente idrolizzata e formula a base di amminoacidi. Le Figure da 2 a 4 mostrano l'analisi dei tre diversi tipi di formulati proteolitici. I FAME principali, inclusi C18:2n6,, ARA e DHA, sono stati facilmente identificati e quantificati. 3 1 C4: C6: C8: C1: C11: C12: C13: C14: C14:1 C1: C1:1 2,27 per isomeri cis/trans di C18:1 e C18:2 C16: C16:1 C17: C17:1 C18: 2,18 per C:2, C21:, C:3n6, C:4n6 (ARA), C:3n3 C:2 C21: C18:3n6 C: C:1 C:2 C21: C:4n6 (ARA) C:3n6 =1,98 per C22: e C:n3 (EPA) C:3n3 C22: C:n3 (EPA) C22:1 C22:2 C23: 1,84 per C24:,, C24: 2,, 7, 1, 12, 1, 17,, 22, C:3n6 C:4n6 (ARA) C:3n3 Figura 1. Cromatogramma GC/FID di una miscela standard di FAME a 37 componenti con una colonna DB-FastFAME Ultra Inert da 3 m,2 mm,,2 µm (codice G ) C8: C1: C12: C14: C16: C18: C: C22: C:n3 (EPA) C:4n6 (ARA) C:1 C22: C24: C24: 2,, 7, 1, 12, 1, 17,, 22, Figura 2. Cromatogramma GC/FID di FAME in un formulato a base di amminoacidi con una colonna DB FastFAME Ultra Inert da 3 m,2 mm,,2 µm. 3
4 C12: 1 1 C16: 8 C14: C8: C1: C18: C:4n6 (ARA) C: C22: C:1 C24: 2,, 7, 1, 12, 1, 17,, 22, Figura 3. Cromatogramma GC/FID di FAME in un formulato altamente idrolizzato con una colonna DB FastFAME Ultra Inert da 3 m,2 mm,,2 µm. C12: 1 1 C16: 8 C14: C8: C1: C18: C:4n6 (ARA) C: C22: C:1 C24: 2,, 7, 1, 12, 1, 17,, 22, Figura 4. Cromatogramma GC/FID di FAME in un formulato parzialmente idrolizzato con una colonna DB FastFAME Ultra Inert da 3 m,2 mm,,2 µm. 4
5 Gli standard di calibrazione di ARA, EPA e DHA sono stati preparati alle concentrazioni di, 1,, 1, 2 e 1. mg/l. Il coefficiente di determinazione (R 2 ) per questi tre composti era,9997. Le Figure, 6 e 7 mostrano le curve di calibrazione. La ripetibilità del metodo è stata testata usando sei iniezioni della miscela standard. La Figura 8 illustra che, per tutti i composti tranne che per C4:, la RSD% dell area era ben al di sotto dell 1%. Ciò dimostra che il sistema GC 88 è un sistema affidabile per l analisi degli acidi grassi. Una colonna con d.i. di,18 mm ad alta efficienza è in grado di migliorare la produttività e di ridurre il tempo di analisi senza ridurre le prestazioni analitiche. Come dimostrato nella Figura 9, l uso di questa corta colonna permette di ottenere un analisi più rapida, in meno di 14 minuti, con una risoluzione quasi equivalente. I valori di risoluzione dei composti principali sono mostrati nelle Figure 1 e 9. Area Concentrazione (ng/µl) Figura. Calibrazione di C:4n6 (ARA) da a 1. µg/ml con una colonna DB-FastFAME Ultra Inert da 3 m,2 mm,,2 μm. Area 1 1 Ris. rel%(3):,63 Correlazione:, Ris. rel%(): 4,996 Correlazione:, Concentrazione (ng/µl) Figura 6. Calibrazione di C:n3 (EPA) da a 1. µg/ml con una colonna DB-FastFAME Ultra Inert da 3 m,2 mm,,2 μm. Area 8 Ris. rel%(6): -4,41e-1 Correlazione:, Concentrazione (ng/µl) Figura 7. Calibrazione di da a 1. µg/ml con una colonna DB-FastFAME Ultra Inert da 3 m,2 mm,,2 μm.
6 Conclusione La presente nota applicativa dimostra che il GC 88 configurato con campionatore automatico e FID rappresenta una soluzione affidabile e più rapida per l analisi di 37 FAME. Sono stati utilizzati due tipi di colonne capillari designate per l analisi dei FAME; entrambi mostrano un efficienza eccellente senza compromettere la risoluzione. La colonna DB-FastFAME da 3 m permette di ottenere una maggiore capacità della colonna e una maggiore durata, mentre la colonna DB-FastFAME da m permette di ottenere un tempo di analisi più breve. L autocampionatore 7693A, con una capacità di 16 vial per campioni, e il controllo EPC del GC 88, garantiscono una buona ripetibilità e facilità di utilizzo adatti all industria alimentare oltre che alle analisi di routine. Bibliografia 1. Zhou, Y.; Wu, H. Improving the analysis of 37 fatty acid methyl esters, Agilent Technologies Application Note, publication number EN, Zhou, Y. Rapid separation of fatty acid methyl esters, Agilent Technologies Application Note, publication number EN, 18. RSD% area (n=6) 1,8 1,6 1,4 1,2 1,,8,6,4,2 C4: C6: C8: C1: C11: C12: C13: C14: C14:1 C1: C1:1 C16: C16:1 C17: C17:1 C18: C18:3n6 C: C:1 C:2 C21: C:3n6 C:4n6 C:3n3 C22: C:n3 C22:1 C22:2 C23: C24: C22:6n3 Figura 8. RSD% dell area di sei iniezioni ripetute della miscela standard di FAME a 37 componenti con una colonna DB-FastFAME Ultra Inert da 3 m x,2 mm,,2 μm C4: C6: C8: C1: C11: C12: C13: C14: C14:1 C1: C1:1 2,12 per isomeri cis/trans di C18:1 e C18:2 C16: C16:1 C17: C17:1 C18: C:2 C21: C18:3n6 1,91 per C:2, C21:, C:3n6, C:4n6 (ARA), C:3n3 C: C:3n6 C:1 C:4n6 (ARA) C:2 C21: C:3n3 C:4n6 (ARA) C:3n6 C:n3 (EPA) C:3n3 C22: C22:1 =1,82 per C22: e C:n3 (EPA) C22: C:n3 (EPA) C22:2 C23: C24: C24: 1,38 per C24:,, Figura 9. Cromatogramma GC/FID di una miscela standard di FAME a 37 componenti con una colonna DB-FastFAME Ultra Inert da m,18 mm,,2 µm (codice G ). Le informazioni fornite possono variare senza preavviso. Agilent Technologies, Inc. 19 Stampato negli Stati Uniti, 19 febbraio ITE
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