DNA Profiling e Genetica Forense. Silvia Fuselli Lezione 1
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- Evangelista Fantoni
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1 DNA Profiling e Genetica Forense Silvia Fuselli fss@unife.it Lezione 1
2 I geni negli individui Omozigote: lo stesso allele ad un locus in organismi diploidi (o poliplodi) E O E Eterozigote: Alleli diversi ad un locus in organismi diploidi (o poliplodi)
3 I geni nelle popolazioni Polimorfico: presenza di >1 tipo genico distinto nella popolazione (variante, forma alternativa) P M P Monomorfico: nella popolazione esiste un solo tipo genico
4 I geni nelle popolazioni Polimorfico: presenza di >1 tipo genico distinto nella popolazione (variante, forma alternativa) Monomorfico: nella popolazione esiste un solo tipo genico Il polimorfismo può essere inteso su scala genetica (esempio: single nucleotide polymorphism, SNP) O su scala popolazionistica (colori, tipi di giaguari in Sud America)
5 Distribuzione nel genoma dei diversi tipi di marcatori molecolari polimorfici Tassi di mutazione (frequenza)
6 I microsatelliti (short tandem repeats, STRs) Sequenze ripetitive di 2-5 paia di basi in tandem
7 Come ottenere un profilo individuale STR (DNA fingerprinting) Raccolta del campione biologico Estrazione del DNA Amplificazione delle regioni di interesse (primer marcati fluorescenti) Lettura dei frammenti con un sequenziatore automatico a capillare
8 Ladder: una specie di legenda Include tutti gli alleli conosciuti (ripetizioni) ad ogni locus in analisi Omozigote 15:15 Eterozigote 14:16 Eterozigote 24:25 Il profilo STR del campione in esme può essere definito confrontando gli alleli con quelli della ladder
9 Single nucleotide polymorphism (SNP) La sequenza genomica di ogni coppia di individui della nostra specie è uguale (in media) per il 99.9%. Circa 1 in 1000 lettere del DNA umano può variare in forma di SNP. Regola generale: 1 SNP ogni 1000 bp all interno della nostra specie, 1 SNP ogni 100 uomo-scimpanzè
10 Polymerase chain reaction (PCR) qualche ora
11 Dal prodotto di PCR al sequenziamento di Sanger C C C
12 Dal prodotto di PCR al sequenziamento di Sanger Verifica dell avvenuta reazione (e possibile quantificazione), ad esempio per elettroforesi su gel di agarosio Prodotto di reazione Marker (frammenti a lunghezza nota) Purificazione del prodotto di PCR: Esempio Exo/SAP (dobbiamo pulire da dntps e primers residui)
13 Il sequenziamento di Sanger Elongation Strand Separation Primer Annealing Termination
14 Termination Standard Nucleotides Dye-labeled dideoxynucleotides ddntp incorporation leads to chain growth termination
15 Capillary Electrophoresis ABI 3730, 96-capillary
16 Un programma specifico opera il BASECALLING (converte i picchi in A, T, G, C) cromatogramma
17 Stranneheim and Lundeberg 2012
18 2000
19 illumina
20 illumina
21 illumina
22 illumina 1800 Gb maximum output Huma genome: 3.3 Gb Che copertura (coverage) ottengo per un genoma con una run?
23 Ion Torrent
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25 Applications Espressione genica Caratterizzazione regioni di interazione DNA-proteine Epigenetica
26 Applications: genomes, exomes, transcriptomes
27 Applications
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30 Applications environmental DNA (edna) Can be avoided
31 library Frammentazione Size selection Legame adattatori Template preparation Serve a reggiungere una quantità di DNA stampo sufficiente per la lettura del sequenziamento sequencing Sequencing by synthesis Lettura del segnale
32 Preparazione della library
33 Preparazione della library Il DNA va pre-processato prima di essere sequenziato Passaggi: 1. Frammentazione (fisica o enzimatica) 2. Le estremità dei frammenti vengono riparate e rese «blunt» o con specifici nucleotidi terminali (es A o T) 3. Alle estremità vengono legati degli adattatori specifici per ogni NGS technology
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35 Preparazione della library
36 Preparazione della library
37 Preparazione della library: Illumina
38 Preparazione della library: Illumina
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44 Gli adattatori P5 e P7 servono per legare il frammento da sequenziare alla flow cell dove ci sono delle sequenze complementari e servono anche da primer
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50 Release of an H+ during extension (Ion Torrent)
51 Quali campioni e quali dati sono tipici della metagenomica? Target capture and variant calling
52 Alcune definizioni Metagenomics: is the study of all genomes present in any given environment without the need for prior individual identification or amplification DNA barcoding: DNA barcoding is a taxonomic method, that uses one or more standardized short genetic markers in an organism s DNA to identify it as belonging to a particular species. Through this method unknown DNA samples are identified to registered species based on comparison to a reference dataset Metabarcoding: biodiversity assessment using DNA barcodes Environmental DNA (edna): complex mixture of genomic DNA from many different organisms found in an environmental sample Microbiome: all the microbes in a community
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54 Metagenomics is the study of genetic material recovered directly from environmental samples. (Wikipedia) Metagenomics is the study of all genomes present in any given environment without the need for prior individual identification or amplification. For example, in its simplest form, a metagenomic study might be the direct sequence results of DNA extracted from a bucket of sea water. (EBI metagenomics) OTU: Operational Taxonomic Unit. The taxonomic level of sampling defined by the researcher in a study; for example, individuals, populations, species, genera, or strains.
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56 Shot-gun (sequenzio tutto!) Amplicon-based
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58 Con i nuovi metodi di sequenziamento e l aumento di informazioni nelle banche dati si può passare ad uno shotgun sequencing (simile ad un sequenziamento genomico, ma di tutto ciò che è stato raccolto nel campione) (vedere il progetto rg/) D (A) Sampling from habitat (B) filtering particles, typically by size (C) DNA extraction and lysis (D) sequencing (E) sequence assembly. E
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Polymerase chain reaction (PCR) qualche ora
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