LA STRUTTURA DELLE PROTEINE È GERARCHICA

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1 LA STRUTTURA DELLE PROTEINE È GERARCHICA

2 LA STRUTTURA DETERMINA LA FUNZIONE The Protein Folding Problem Cosa determina la struttura? Energia Cinetica Come si determina la struttura? Metodi Sperimentali Predizione compiutazionali

3 Proteine sono sintetizzate come polimeri lineari

4 Le proteine condensano in una precisa ed unica struttura 3D

5 Perché una proteina condensa in una struttura 3D? La proteina Folded è poco più stabile della forma denaturata Contributo Entalpico è poco superior dell Entropico

6 Non l H2O! dimentichiamo

7 Effetto idrofobico innesca il folding proteico Folding G = kj mol 1 Unfolded protein disordered (high entropy) few noncovalent (enthalpic) interactions Folded protein highly ordered (low entropy) many noncovalent interactions La proteina quando è Folded subisce una grande diminuzione di Entropia I gruppi idrofobici nascosti all interno della proteina causano un aumento di entropia dell H2O

8 L Effetto idrofobico innesca il folding Il Folding proteico è la soluzione per minimizzare l esposizione di residui idrofobici con l H2O. La diminuzione di Entropia che subisce la proteina nel processo di Folding è compensate da: (i) L incremento dell entropia delle molecule dell H2O quando I residui non polari sono nascosti all interno della proteina. (ii) Un piccolo numero di interazioni non covalenti (H-bonds and electrostatic interactions) che stabilizzano lo stato foldado = la struttura biologicamente attiva incrementano Entalpia.

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13 Cosa determina il Folding? The Anfinsen paradigm Ribonuclease A Anfinsen paradigm: L informazione per il corretto folding proteico è contenuta nella sequenza degli aminoacidi Christian Anfinsen ha ricevuto il Nobel Prize nel 1972

14 L esperimento di Christian B. Anfinsen L ipotesi termodinamica (almeno) per piccole proteine la struttura nativa è determinata esclusivamente dalla struttura primaria. Premio Nobel per la Chimica nel 1972 March 26, 1916 May 14, 1995 La struttura nativa è quella termodinamicamente più stabile (a minore energia- diminuzione di entalpia ed entropia) tra quelle cineticamente accessibili.

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17 The Anfinsen paradigm

18 PROTEINE CON STRUTTURE 1 SIMILI HANNO STRUTTURE 3 ANALOGHE tuna yeast rice 1 GDVAKGKKTFVQKCAQCHTVENGGKHKVGPNLWGLFGRKTGQAEGYSYTDANKSKGIVWN 1 GSAKKGATLFKTRCLQCHTVEKGGPHKVGPNLHGIFGRHSGQAEGYSYTDANIKKNVWDE 1 GNPKAGEKIFKTKCAQCHTVDKGAGHKQGPNLNGLFGRQSGTTPGYSYSTANKMAVIWEE tuna yeast rice 61 ETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKGERQDLVAYLKSATS 61 NNMSEYLTNPKKYIPGTKMAFGGLKKEKDRNDLITYLKKACE 61 NTLYDYLLNPKKYIPGTKMVFPGLKKPQERADLISYLKEATS

19 Conformational preferences of amino acids

20 Conformational preference is context dependent

21 L EFFETTO IDROFOBICO Importante per il folding poichè ogni amminoacido da il suo 2.25 Trp 0.26 Thr 1.80 Ile 0.13 His 1.79 Phe 0.00 Gly 1.70 Leu Ser 1.54 Cys Gln 1.23 Met Asn 1.22 Val Glu 0.96 Tyr Asp 0.72 Pro Lys 0.31 Ala Arg Experimentally Determined Hydrophobicity Levels Fauchere and Pilska (1983). Eur. J. Med. Chem. 18,

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25 QUICK OVERVIEW OF ENERGY Bond H-bonds Ionic bonds Hydrophobic interactions Van der vaals interactions Disulfide bridge Strength (kcal/mole)

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35 Il paradosso di Levinthal può essere considerato un enigma relativo alle dinamiche del folding proteico. Cyrus Levinthal si rese conto che, a causa dell'elevato numero di gradi di libertà di un polipeptide non ripiegato, tale molecola presenterebbe un numero astronomico di possibili conformazioni finali Proteina di 100 residui Due gradi di libertà torsionali/residuo (phi,psi) 3 conformazioni accessibili per ogni grado di libertà torsionale 32x100 possibili conformazioni Se la proteina fosse in grado di esplorare una nuova conformazione ogni sec Tempo richiesto per esplorare tutte le conformazioni: t = 1087 sec=20 x 109 anni! Se la proteina raggiungesse la sua conformazione finale passando via via attraverso tutte queste configurazioni, sarebbe necessario un tempo ben superiore all'età attualmente stimata dell'universo per raggiungere la configurazione corretta.

36 The Levinthal paradox Le proteine si devono ripiegare seguendo un cammino definito, caratterizzato da conformazioni via via piu stabili (diminuizione di G). La struttura nativa è quella termodinamicamente più stabile tra quelle cineticamente accessibili.

37 Ipotetica via di ripiegamento delle proteine Le proteine seguono un percorso specifico per il ripiegamento e raggiungono la loro conformazione nativa in meno di qualche secondo: il ripiegamento avviene attraverso vie dirette piuttosto che attraverso la scelta casuale della struttura. Il ripiegamento comincia con la formazione di segmenti locali di struttura secondaria (5millisecondi). Ciò favorisce il successivo collasso idrofobico dei nuclei idrofobici compatti all interno della proteina.

38 Diagramma energia entropia del ripiegamento delle proteine Una proteina che si ripiega deve procedere da uno stato ad alta energia ed entropia ad uno stato caratterizzato da bassi livelli di energia ed entropia (folding funnel, imbuto di ripiegamento).

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44 MOLTEN GLOBULAR

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47 PROTEIN DENATURATION Denaturation disruption of native conformation Heat commonly used to denature proteins Tm = temperature where 50% folded/50% unfolded. Typical Tm = o C Tm for thermophiles >100 o C (Taq DNA polymerase) Chemical denaturants Chaotrophic agents = Urea, KCN detergents = SDS Tm

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