I virus vegetali nella formulazione di un vaccino contro il virus HIV-1

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1 "Molecular Farming: produzione di cibi funzionali, di nutraceutici e biofarmaceutici" ENEA - Casaccia 4 Dicembre 2003 I virus vegetali nella formulazione di un vaccino contro il virus HIV-1 Carla Marusic UTS BIOTEC-GEN ENEA - Trisaia

2 Piante come biofabbriche per la produzione di vaccini Vs

3 Molecole a scopo vaccinale espresse in piante transgeniche Vaccini in trial clinico Nature Reviews Genetics (2003) Vol.4;

4 Trasformazione della cellula vegetale 1) Trasformazione stabile mediata da Agrobacterium Cellula vegetale Nucleo Nucleo DNA della pianta Gene inserito Proteina estranea 2) Trasformazione transiente mediata da Virus Vegetali (PVX) Cellula vegetale Vettore virale DNA della pianta Nucleo Nucleo Replicazione del virus Proteina estranea

5 Confronto tra due sistemi di espressione in pianta Vaccine 19 (2001)

6 Strategie di clonaggio per l espressione di molecole vaccinali mediata da virus vegetali Genoma virale WT Replicasi Movimento Proteina di rivestimento Genoma virale modificato A) Gene estraneo + B) Particelle Virali Chimeriche

7 Molecole a scopo vaccinale espresse mediante virus vegetali Patogeno Pianta Proteina Sistema di Espressione Bibliografia Virus di Norwalk Tabacco/ Patata Proteina di rivestimento del virus di Norwalk Virus vegetale AMT Trends Biotechnol. 15, (1997) Influenza Tabacco Emoagglutinina Virus vegetale TMV Engineering plants for commercial products and applications (eds. Collins G.B. and Sheperd, R.J.) 1996 HIV Tabacco/ Fagiolo HIV epitopo (gp120) Virus vegetale AMT/CPMV Curr. Opin. Biotechnol. 11, (2000) N. benthamiana HIV epitopo (gp41) Virus vegetale PVX J.Virol. Vol 75, (2001) Streptococcus mutans (agente della carie) Tabacco proteina di superficie SpaA Virus vegetale AMT Microbes Infect. 1, (1999).

8 Produzione di vaccini mediante esposizione su virus vegetali, principali vantaggi : La produzione e validazione di un nuovo vaccino può essere ottenuta in tempi molto brevi Facilità di manipolazione del genoma virale Elevati livelli di produzione di virus ricombinante per peso fresco di tessuto infetto Purificazione del virus rapida ed efficiente Molti virus vegetali sono stabili a temperatura ambiente Ciascuna particella virale può esporre molte copie del frammento proteico scelto (da 60 fino a 2,000 copie per virione)

9 Programma Nazionale di Ricerca sull AIDS Progetto: Piante ingegnerizzate come biofabbriche per la formulazione di vaccini. Sviluppo di un vaccino anti HIV-1

10 Vaccino contro HIV-1: una sfida Il virus HIV-1 muta molto velocemente Il virus deve essere bloccato in una fase precoce dell infezione Scelta dell antigene, punti cruciali: Variazioni nella conformazione delle proteine virali (isolati primari e ceppi di laboratorio). Attivazione del sistema immunitario per indurre la produzione di anticorpi neutralizzanti capaci di bloccare il virus nelle primissime fasi dell infezione. Induzione di una risposta immunitaria di tipo cellulare con produzione di cellule del sistema immunitario specializzate in grado di eliminare il virus ed eventuali cellule infettate.

11 Proteine coinvolte nel processo di penetrazione del virus HIV-1 all interno della cellula bersaglio

12 Modello della struttura della glicoproteina gp41 Broadly Neutralizing Antibodies Targeted to the Membrane-Proximal External Region of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Glycoprotein gp41 MICHAEL B. ZWICK et al. JOURNAL OF VIROLOGY, 2001, p

13 Particelle di virus X della patata (PVX) che espongono sulla loro superficie una porzione della proteina gp41 di HIV-1 Clonaggio della sequenza HIV-1 nel genoma del PVX gp 41 (2F5) PVX-2F5 HIV-1 Ogni Particella Virale Chimerica di PVX è costituita da circa 1300 molecole di CP.

14 Pianta infettata con il PVX-2F5 Purificazione del virus CsCl gradient OD Gli estratti di pianta reagiscono con anticorpi umani anti HIV-1 C- WT-PVX PVX-2F5E

15 Immunizzazione di topi con il virus PVX-2F5 Per via intraperitoneale Per via intranasale Prelievi Immunizzazioni Giorni

16 Risposta immunitaria indotta dal virus PVX-2F5 PVX-2F5E IgG (Somministrazione IN) WT-PVX OD IgG (Somministrazione IP) IgA (Somministrazione IN) Giorni

17 Il PVX-2F5 induce la produzione di anticorpi umani in un modello murino umanizzato SCID (Severe Combined Immuno-Deficient Mice) Prelievo da un donatore sano Topo SCID ricostituito con cellule umane del donatore sano Immunizzazione con le cellule dendritiche trattate Prelievi ed analisi dei sieri Gradiente di densità Identificazione di Anticorpi umani anti-hiv Topi trattati Topi controllo Topi controllo Purificazione di cellule mononucleate del sangue periferico Cellule Dendritiche umane trattate con il virus PVX-2F5 O.D.405 nm Giorni

18 Saggio di Neutralizzazione del virus HIV-1 in vitro HIV-1 IIIB % Di Neutralizzazione Diluizione del siero M1 M4 H4 M7 H6 Siero topi SCID Siero topi C57BL/10 Cellule in coltura Inibizione della formazione di sincizi indotta dal virus HIV-1

19 Produzione di un vaccino mediante virus vegetali 1) Identificazione della sequenza di interesse Gp41 epitopo 2F5 2) Clonaggio nel vettore virale CsCl gradient 3) Infezione della pianta e purificazione del virus 4) Esperimenti di immunizzazione in modelli animali

20 Conclusioni Le Particelle Virali Chimeriche PVX-2F5 espongono un epitopo di HIV-1 altamente conservato. Inducono una potente risposta immunitaria neutralizzante sia in topi normali che nel modello umanizzato SCID (Hu-PBL-SCID). L immunizzazione per via intranasale induce la produzione di alti livelli di anticorpi associati alle mucose (IgA). La risposta immunitaria è stata ottenuta senza l aggiunta di adiuvanti.

21 Manipolazione del PVX, infezioni di pianta, purificazione del virus, analisi dei sieri. Immunizzazioni e prelievi. Modello SCID e saggi di neutralizzazione in vitro. Brevetto Congiunto ENEA ISS Inventori: Benvenuto E., Marusic C., Belardelli F. Rizza P., Capone I EP A3

22 Progetti futuri Valutare l efficacia del sistema PVX nell induzione di risposte immunitarie di tipo cellulare Capire l effetto di PVX come adiuvante Valutare/verificare la sicurezza del sistema PVX in modelli animali e nell uomo Costruire nuove Particelle Virali Chimeriche per la formulazione di un vaccino multicomponente SIXTH FRAMEWORK PROGRAMME PRIORITY [LSH ] RECOMBINANT PHARMACEUTICALS FROM PLANT FOR HUMAN HEALTH (PHARMA-PLANTA)

23 Collaboratori esterni Selene Baschieri Chiara Lico Floriana Capuano Camillo Mancini Filippo Belardelli Direttore del Laboratorio di Virologia Istituto Superiore di Sanita, Roma Eugenio Benvenuto Responsabile di progetto