A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per l organismo. Un problema esistenziale: Masochismo cellulare:

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1 All mammalian cells are primed to commit suicide Istologia APOPTOSI Colpisce cellule isolate in tessuti vitali MORTE CELLULARE NECROSI Muoiono gruppi di cellule distruggendo la struttura del tessuto Citologia Nuclei frammentati e citoplasma condensato Edema cellulare e nuclei intatti Colorazione Coloranti inizialmente esclusi Membrane permeabili ai coloranti Citoplasma Citoplasma compatto e organuli intatti Nucleo Cromatina condensata (semilune) Mitocondri rigonfiati Cromatina a distribuzione normale Circostanze Morte programmata, Atrofia Uccisione immunitaria cellulomediata, tossine (basse dosi) Ipossia e tossine (alte dosi) October, 2000 August 1998 marzo Effetti tissutali Nessuna infiammazione Fagocitosi da parte di cellule adiacenti Infiammazione acuta Quale vantaggio per l organismo? marzo Un problema esistenziale: Perché una cellula dovrebbe suicidarsi? Masochismo cellulare: Perchè programmare la morte? marzo A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per l organismo 1. Normale sviluppo embrionale 2. Distruzione di cellule che rappresentano una minaccia per l integritá dell organismo 3. Controllo della popolazione cellulare di un tessuto (omeostasi) 4. Eliminazione di cellule proprie pericolose 5. Possibilità di modulare la funzione di un organo. marzo

2 Apoptosi e difesa dell organismo Contro cellule infettate da virus (ad opera di linfociti T citotossici); Contro cellule del sistema immune autoreattive; Contro cellule in cui si verifica un danno al DNA; Contro cellule tumorali. marzo Apoptosi : Processo attivo (richiede ATP) che viene indotto da segnali esogeni o endogeni e che serve ad eliminare, senza conseguenze cellule indesiderate infiammazione Processi fisiologici Segnale Durante lo sviluppo embrionale, per l involuzione di strutture Recettoriale Durante l involuzione ormone dipendente dell adulto Recettorilae Eliminazione dei neutrofilie macrofagi dopo l infiammazione acuta Recettoriale Eliminazione dei linfociti T autoreattivi Recettoriale Eliminazione di cellule il cui DNA è stato danneggiato, Danno al DNA per evitare accumulo di mutazioni che possono causare insorgenza di neoplasie (tumori) Elimnazione di cellule tumorali da parte dei linfociti T citotossici Antigeni di marzo membrana Risoluzione dell infiammazione acuta, in seguito ad un limitato danno tissutale. Ruolo fondamentale dell apoptosi e fagocitosi sangue linfa Liquidi e proteine monocita neutrofilo macrofago fagocitosi neutrofilo apoptotico macrogafo apoptotico marzo marzo

3 L apoptosi é implementata mediante l attivitá ordinata di enzimi specifici, che agiscono prima della perdita dell integritá della membrana cellulare. marzo Caratteristiche morfologiche dell apoptosi Raggrinzimento cellulare; Condensazione e frammentazione della cromatina; Formazione di protuberanze ( blebs ) citoplasmatiche e di corpi apoptotici; Fagocitosi da parte di macrofagi o cellule non specializzate adiacenti marzo Caratteristiche morfologiche 1. Addensamento del citoplasma Condensazione della cromatina (marginale) Osservazione in-vivo 4. Fagocitosi da parte delle cellule adiacenti 2. Frammentazione del nucleo Formazione di estroflessioni citoplasmatiche 3. Formazione dei corpi apoptotici Le cellule blebbing sono ancora vitali (saggio del Trypan bleu); La transizione normale-raggrinzito-blebbing é rapida (10-30 ), le cellule vengono poi fagocitate. Istologicamente, l apoptosi é quindi difficile da evidenziare a meno di un esteso coinvolgimento cellulare. 5. Fagocitosi da partedei macrofagi marzo marzo

4 Membrane blebbing In vitro Dopo il blebbing, c é la vera e propria frammentazione cellulare in corpi apoptotici I corpi apoptotici vengono quindi fagocitati In situazioni -anche in vivo- in cui la apoptosi é massiva (es., nei tumori), cellule apoptotiche possono restare non fagocitate ed andare incontro a necrosi secondaria marzo marzo Caratteristiche biochimiche dell apoptosi Degradazione proteica ad opera di proteasi specifiche (caspasi) Cross-linking proteico ad opera della Transglutaminasi II Frammentazione del DNA: formazione del DNA ladder Attivazione di una flippasi e conseguente espressione di fosfatidilserina sulla parte esterna della membrana cellulare marzo Phosphatidylserine flipping In normal cells, most of the PS contained in the plasma membrane is oriented towards the cytoplasmic side of the cell membrane. In early stage of apoptosis, the cell undergoes surface membrane blebbing, cytoplasmic shrinkage, nuclear DNA fragmentation, chromatin condensation and PS translocation across the plasma membrane to the exposed outer surface of the cell. It is thought that the PS on the membrane surface identifies the cell as a target for destruction by the immune system. marzo

5 Come si osserva sperimentalmente l apoptosi? Methods for detecting cell death Morphological criteria DNA ladders Sfruttando la presenza di attività endonucleasiche si può evidenziare l apoptosi di una determinata popolazione cellulare semplicemente osservando l integrità del DNA genomico. TUNEL staining (TdT-mediated dutp-biotin nick end labelling) marzo marzo marzo marzo

6 marzo marzo Come si osserva sperimentalmente l apoptosi? Principle of TUNEL assay Nucleotidi vengono coniugati con digoxigenin e aggiunti enzimaticamente al DNA ad opera della terminal deoxynucleotidyl-transferase (TdT). Il DNA marcato viene rivelato grazie all utilizzo di un anticorpo anti-digoxigenin opportunamente coniugato con una molecola rivelatrice (fluorocromo, perossidasi, etc.). Apoptosi indotta in cellule HeLa mediante trattamento con aphidicolin, una sostanza che inibisce la sintesi del DNA. marzo marzo

7 TUNEL - labelled cells TUNEL - labelled cells ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit using human lymphnode tissue. The data reveals the unique association of DNA fragmentation labeling (brown) with apoptotic cell morphology such as membrane blebbing and nuclear condensation (methyl green counterstain). marzo ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit with mouse embryo forelimb bud tissue. Green fluorescence indicates apoptotic cells amongst normal cells (propidium iodide counterstain) that lead to the development of digits in the mature mouse forelimb. marzo TUNEL - labelled cells TUNEL E-E TUNEL ApopTag Red applied to ApopTag Positive Control Slides. The rhodamine fluorescence indicates apoptotic cells in rat mammary gland tissue, 3 days post weaning. marzo 2005 Leukemic spleen 28 marzo

8 Useful References Evoluzione dell apoptosi Nature - Vol 407 (2000) A comprehensive review issue. Schwartz LM and Osborne BA (1995). Cell Death. Methods in Cell Biology - Volume 46. Academic Press marzo L apoptosi esiste in tutti gli organismi pluricellulari Organismi monocellulari: presente in forme piú o meno simili anche nei batteri, forse in difesa contro infezioni virali (che a loro volta hanno escogitato numerosi stratagemmi per inattivare il programma apoptotico endocellulare) marzo Lo studio dell apoptosi in C. elegans Caenorhabditis elegans is a small (about 1 mm long) soil nematode found in temperate regions. Durante lo sviluppo di C. elegans, si formano 1090 cellule: 959 resteranno a far parte del verme adulto (post-mitoticamente) e 131 vanno incontro ad apoptosi. Ricerca di mutazioni in cui il pattern di morte cellulare é alterato: identificazione di regolatori apoptotici poi ritrovati anche in mammiferi marzo marzo

9 Geni effettori in C. elegans ced-3 e ced-4: mutazioni che li inattivano portano alla conservazione di tutte e 131 le cellule condannate a morte ced-9: mutazioni che inattivano ced9 portano a morte cellulare estesa a tutte le cellule, livelli aumentati di espressione di CED-9 bloccano l apoptosi. Omologie in organismi superiori: Ced-9 ced-9 é altamente omologo a bcl-2 bcl-2 é un oncogene: livelli di espressione elevati nei linfomi follicolari a cellule B ed in altre neoplasie Come ced-9 nel verme, anche bcl-2 protegge le cellule da stimoli apoptotici: le cellule tumorali risultano quindi piú resistenti marzo marzo Ced-3 e Ced-4 ced-3 codifica per una cisteino-proteasi che taglia il suo substrato dopo residui di aspartato (caspasi) Almeno 14 caspasi sono state identificate nei mammiferi coinvolte, in maniera diversa, nel programma apoptotico Le caspasi sono sintetizzate come pro-enzimi inattivi i quali subiscono un processo di proteolisi per generare la forma attiva Ced-4: omologo di Apaf-1, sia nel verme che nei mammiferi regola l attivitá delle caspasi L inizio dell apoptosi Fase 1: allestimento di apparati specializzati che permette all apoptosi di avvenire (iniziazione) ed è caratterizzata dalla comparsa di attività enzimatiche quali la transglutaminasi e le endonucleasi. Fase 2: è rappresentata dall avvio del processo apoptotico vero e proprio. marzo marzo

10 Le fasi del programma apoptico 1. Decisione se iniziare o meno la procedura di suicidio cellulare 2. Commitment: passaggio del punto di non ritorno 3. L esecuzione La decisione: i segnali Fattori (pro- o anti-apoptosi) che agiscono segnalando a livello di membrana cellulare: ormoni, citochine, fattori di crescita, interazione fra recettori e ligandi della famiglia del TNF (tumor necrosis factor) Segnali intracellulari: legame di ormoni steroidei a recettori nucleari, agenti chimico-fisici, infezioni virali marzo marzo La decisione ed il passaggio del punto di non ritorno Proteine regolatorie hanno il compito di integrare i segnali pro- ed antiapoptotici (intra- ed extra-cellulari) e a seconda delle circostanze avviare o meno l esecuzione 1. Adattatori, in grado di trasdurre direttamente segnali apoptotici agli esecutori 2. Regolatori della funzionalitá mitocondriale marzo Il ruolo del mitocondrio nell apoptosi Il citocromo C (che normalmente risiede nello spazio fra la membrana interna ed esterna mitocondriale, e funziona nel pathway respiratorio mitocondriale) viene rilasciato dai mitocondri nel cytosol dopo stimoli apoptotici Cyt c forma un complesso con Apaf-1 (l omologo di Ced-4) e con la caspasi 9 in forma inattiva: questo complesso macromolecolare (apoptosoma) in presenza di ATP porta ad autoattivazione della procaspasi 9, che in forma attiva va quindi ad innescare la fase di esecuzione marzo

11 Apotosi controllata dal mitocondrio Cambiamento della permeabilità solo della membrana esterna del mitocondrio: controllata da Bax e Bcl-2 Fuoriuscita del citocromo c che si complessa ad Apaf1 e susseguente attivazione delle caspasi marzo marzo Che cosa succede quando l apoptosi non funziona? marzo marzo

12 Patologie associate all aumento aumento dell apoptosi apoptosi: Malattie degenerative: morte di neuroni specifici Morbo di Parkinson ( nenroni dopamminergici) Alzeimer Atrofia muscolare spinale SEGNALE accumulo di ROS alfa-amilode Danno ischemico Infarto del miocardio da danno ischemico deplezione ATP, ROS Ictus cerebrale da danno ischemico Immunodeficienza acquisita: Aids: Deplezione dei linfociti T-helper Patologie associate alla inibizione apoptosi: Neoplasie: MutazionI di geni che regolano l apoptosi in risposta al danno al DNA Soppressione dell immunosorveglianza: eliminazione delle cellule tumorali da parte delle cellule T citotossich Autoimmunità: mancata eliminazione dei linfociti T autoreattivi marzo marzo marzo marzo

13 Mancanza di apoptosi interdigitale marzo marzo Mancanza di attivazione della caspasi 3 Diminuita apoptosi in vitro di cellule Apaf-1 -/- marzo marzo

14 Che cosa determina il rilascio del citocromo c? Il rilascio del citocromo c precede i cambiamenti morfologici dell apoptosi, incluso il flipping della fosfatidilserina Tutto il citocromo c é rilasciato dai mitocondri di una cellula in meno di 5 minuti Secondo un modello corrente, il rilascio del citocromo c deriva dalla previa apertura di un megacanale mitocondriale (PTP, permeability transition pore ) che attraversa entrambe le membrane mitocondriali marzo marzo La permeabilitá delle membrane mitocondriali Secondo dati recenti ancora da confermare, il rilascio del citocromo c precede la caduta del potenziale di membrana mitocondriale che si osserva quasi invariabilmente durante l apoptosi marzo marzo

15 marzo marzo Cyt c-gfp prima/dopo stress marzo La famiglia di Bcl-2 Bcl-2 (omologo di Ced-9) é un fattore mitocondriale anti-apoptotico La sua attivitá é regolata da altri membri della famiglia: anti-apoptotici (Bcl-XL, ecc.) e proapoptotici (Bax, Bad, Bid, ecc.) Alcuni di questi fattori sono costitutivamente mitocondriali, altri (Bax, Noxa, Bid) rilocalizzano nei mitocondri in seguito a stimoli apoptotici Membri della famiglia pro- ed anti-apoptotici sono in grado di interagire fra loro: Bax ed altri sopprimono la capacitá di Bcl-2 di proteggere la cellula marzo

16 Funzione della famiglia di Bcl-2 Il rapporto Pro/Anti (Bax/Bcl-2) funge da reostato cellulare 1. Azione come canali: diversi membri della famiglia sono in grado di formare canali dopo oligomerizzazione. Canali di Bax sono in grado di promuovere il rilascio del cyt c, mentre la presenza di bcl-2/xl sulla superficie esterna della membrana mitocondriale esterna potrebbe sfavorire il rilascio di cyt c 2. Inibizione dell attivazione di caspasi (vedi C. elegans) marzo Altre proteine rilasciate dal mitocondrio Smac/Diablo (pro-apoptosi) é in grado di inattivare le IAPs (inibitori endogeni o virali delle caspasi): l importanza relativa di questo pathway rispetto a quello mediato dal rilascio del cyt c é in fase di studio AIF é uno dei fattori responsabili per i cambiamenti nella morfologia nucleare associati all apoptosi: sembra essere coinvolto nell apoptosi solo in seguito a particolari stimoli (p.es. in vitro dopo deprivazione di siero) marzo L esecuzione Cascata di eventi di degradazione proteica mediata da caspasi Substrati: Bcl-2/XL, Bid, ICAD, lamine, ecc., che portano ai cambi morfologici tipici della apoptosi Rimozione del cadavere : un area di attivo studio. É cosí efficiente che reazioni infiammatorie sono praticamente assenti. Esempi di specifici programmi apoptotici marzo marzo

17 Apoptosi classica: caspasi dependente Segnalazione : segnali capaci di attivare meccanismi di trasduzione (integrazione) che permettono l esecuzione Danno al DNA, Tossine, Stress ossidativo Membrana plasmatica Integrazione: Tramite l attivazione di proteine regolatorie che consentono l attivazione delle proteine effettrici Mitocondrio Fase effettrice: distruzione del citoscheletro, della matrice nucleare e freammentazione del DNA marzo marzo Apoptosi da linfociti T citotossici FAS (APO1 o CD95) espresso in fegato, cuore polmoni, tumori FAS-L linfociti T attivati Formazione di canali di perforina nella cellula bersaglio, e secrezione di granuli contenenti Granzima B Il Granzima B attiva direttamente caspasi esecutrici del programma apoptotico marzo marzo

18 Extrinsic Extrinsic pathway. E.g. Fas/ fas ligand marzo marzo Fas receptor (CD 95) : quando attivato dal ligando induce apoptosi Delezionedi linfociti T attivati Eliminazione di cellule infette das virus Eliminazione delle cellule infiammatorie Il pathway dei death receptors Death effector domain, DED Caspase 8 Effector caspases,, e.g., caspase-3 Ligando - Fas L (CD95L) Recettore Fas (CD95) Death domain, DD Fas-associated death domain, FADD marzo 2005 Apoptosi 71 L attivazione dei recettori della superfamiglia dei recettori del tumor necrosis factor (TNF) puó portare direttamente all attivazione delle caspasi Il ligando per questi recettori esiste o sulla membrana cellulare o in forma solubile in forma trimerica, ed il suo legame al recettore induce aggregazione del recettore marzo

19 TNFR1 receptor: può indurre induce apoptosi in assenza TNFR associated death domain, TRADD Receptor interacting protein, RIP TNFR-associated factor 2, TRAF2 NFkB IKK JNKK JNK JunD Ligando -TNF Recettore TNFR1 Caspase 8 Effector caspases Apoptosis Death domain, DD Fas-associated death domain, FADD In presenza di sintesi proteica induce espresssione di NK-kB e c-jun, fattori trascrizionali c he inibiscono l apoptosi e modulano la risposta infiammatoria e immunitaria (NF-Kb) marzo Gli adattatori I recettori posseggono un dominio intracellulare ( death domain ) Dopo il legame del ligando, tali domini reclutano degli adattatori (FADD, TRADD) FADD possiede un death effector domain, che media associazione con la procaspasi 8, attivazione a caspasi 8 e susseguente attivazione di altre caspasi esecutrici (caspasi 3) e/o attivazione proteolitica di Bid marzo FADD Bax marzo marzo

20 Cells contain survival mechanisms Induction of NF-!B: liberation from I! B and translocation to the nucleus marzo No NF-kB induction = liver apoptosis during embryogenesis marzo T. Maniatis Science 278: 818 TRAIL ricombinante é tossico solo per cellule tumorali Il pathway di TRAIL marzo marzo

21 TRAIL non induce apoptosi nelle cellule normali (topo) in vivo TRAIL causa regressione tumorale in vivo Controllo TRAIL FAS-L marzo marzo TRAIL induce apoptosi delle cellule tumorali in vivo TRAIL potrebbe essere un farmaco efficace? marzo marzo

22 TRAIL ricombinante puó indurre apoptosi in particolari istotipi di cellule umane -non murine- normali TRAIL Bax Apoptosi Sopravvivenza Bax Apoptosi marzo marzo TRAIL + chemioterapia Bax- Bax- Attivazione di Casp8 Aumento di Bak Apoptosi marzo marzo

23 Apoptosi e tumorigenesi Molecole anti-apoptotiche iperespresse nelle cellule tumorali (bcl-2, bcl-xl, IAP); Molecole pro-apoptotiche spente trascrizionalmente nelle cellule tumorali (caspasi 8, fas, TRAIL); Pathway anti-apoptotici ipertrofici nelle cellule tumorali (NF-kB, Akt); Pathway pro-apoptotici atrofici nelle cellule tumorali (p53). Strategie pro-apoptotiche Antagonisti di bcl2-bclxl Oligonucleotidi Antisense Inibitori di bcl2 Agonisti di TRAIL TRAIL ricombinante Anti-TRAIL-receptor Inibitori di IAP marzo marzo A A) Fotografia al microscopio elettronico a trasmissione di un linfocita apoptosico della corticale del timo: sono evidenti i vacuoli dilatati del RE, una banda di cromatina condensata alla periferia del nucleo (N) ed i mitocondri che mantengono una morfologia normale B C Fotografie al microscopio elettronico a scansione: le figure B e C ritraggono due cellule di cui una marzo marzo normale e l altra apoptotica.non è difficiledistinguerle vero?!