Indice. Informazioni sulla sicurezza 2. Pulizia e smaltimento 4. Specifiche 4. Informazioni per gli ordinativi del sistema FlashGel 33

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1 Sistema FlashGel Lonza Rockland, Inc. Supporto scientifico: Servizio clienti: Rockland, ME 04841

2 Indice Informazioni sulla sicurezza 2 Pulizia e smaltimento 4 Specifiche 4 Guida rapida al sistema FlashGel 6 Istruzioni per il sistema FlashGel per DNA 10 Istruzioni per il sistema FlashGel per RNA 19 Istruzioni per il sistema di recupero FlashGel 25 Informazioni per gli ordinativi del sistema FlashGel 33 Informazioni sulla garanzia e la responsabilità 35 Informazioni sulla licenza e sul marchio 36 1

3 Sistema FlashGel Importanti informazioni sulla sicurezza Simboli di sicurezza I seguenti simboli hanno lo scopo di allertare l utilizzatore su importanti requisiti operativi, manutentivi e/o di garanzia o sull esposizione a possibili pericoli. ATTENZIONE: Tensione pericolosa Il contatto può causare decesso e lesioni gravi Porre attenzione nella messa in funzione di questo sistema in quanto può sviluppare una tensione e corrente sufficienti a produrre una scossa letale. Per evitare rischi di lesione, il sistema va messo in funzione da personale adeguatamente addestrato e sempre in conformità alle istruzioni fornite. Prima di accendere l alimentazione CC, controllare che il cavo nero sia collegato al terminale negativo e che il cavo rosso sia collegato al terminale positivo. Non toccare il dock o la cassetta FlashGel mentre è accesa l'alta tensione. Non riempire i pozzetti, aggiungere campioni o estrarre bande mentre i cavi dell alta tensione sono collegati all alimentazione. La mancata osservanza di queste istruzioni può portare a rischi personali e/o per il laboratorio e a rendere nulla la garanzia. Spegnere sempre la fonte di alimentazione CC prima di togliere le cassette dal dock. Per la massima sicurezza, mettere sempre in funzione il sistema in un area isolata, non frequentata e non 2

4 accessibile a personale non autorizzato. Non mettere mai in funzione apparecchiatura rotta o danneggiata. Precauzioni Per la visualizzazione dei frammenti, il dock FlashGel utilizza la tecnologia del transilluminatore Dark Reader (Clare Chemical Research, Inc.). È sicuro visualizzare le cassette sul dock illuminato senza protezione della luce UV. Accendere la luce solo dopo che la cassetta è al suo posto. Non guardare direttamente nella luce. ATTENZIONE. Usare la maschera FlashGel per bloccare la luce dalla seconda fila dei pozzetti quando vengono usate le cassette di recupero a doppia fila o FlashGel. Indossare guanti, camici e occhiali di sicurezza quando si manipolano le cassette FlashGel. Il gel ed la soluzione tampone nelle cassette FlashGel contengono un gel di acidi nucleici proprietario che è un potenziale mutageno. Attenersi alle normative locali e nazionali in vigore per la manipolazione e smaltimento di questi materiali. ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione non invertire gli elettrodi per far correre il campione in senso inverso. Condizioni operative del dock FlashGel Limiti massimi Unità elettroforesi: 300 V CC alta tensione, ingresso CC potenza 15 watt corrente 50 ma Luce del dock: 18 V CC bassa tensione, ingresso CC Condizioni ambientali Condizioni operative: Temperatura: 15 C-35 C Umidità: 15%-85% umidità relativa, senza condensa Conservazione e condizioni per il trasporto (FlashGel Dock) Temperatura: 2 C-60 C Umidità: 15%-85% umidità relativa, senza condensa 3

5 Pulizia e smaltimento Procedura di pulizia ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione, non pulire il dock mentre è collegato all alimentazione ad alta tensione. Pulire il dock FlashGel con un panno imbevuto in acqua o soluzione detergente delicata. Non immergerlo! Smaltimento Il colorante presente nelle cassette FlashGel è un potenziale mutageno. Attenersi alle normative locali e nazionali in vigore per lo smaltimento di questi materiali. Specifiche Range di separazione: cassette di DNA 1,2%: più lunghi) cassette di DNA 2,2%: cassette di RNA 1,2%: cassette recupero 1,2%: 50 bp 4 kb (fino a 10 kb con tempi di corsa 10 bp 1 kb 0,5 kb 9 kb 50 bp 4 kb Conservazione delle cassette: Cassette di DNA: 18 C-26 C per 5 mesi dalla data di fabbricazione Cassette di RNA: Inviare una richiesta Cassette di recupero: 18 C-26 C per 5 mesi dalla data di fabbricazione Volume del pozzetto: pozzetti: Non superare i 5 μl di campione/pozzetto pozzetti: Non superare i 5 μl di campione/pozzetto pozzetti: Non superare i 12 μl di campione/pozzetto Dimensione del gel: 70 mm (Lungh.) x 84 mm (Largh.) x 2 mm (Alt.) Dimensione cassetta: 115 mm (Lungh.) x 107 mm (Largh.) x 17 mm (Alt.) 4

6 Dimensione del dock: 134 mm (Lungh.) x 120 mm (Largh.) x 54 mm (Alt.) Contenuto della cassetta Gel di agarosio, colorante e soluzione tampone Valori nominali dell apparecchiatura Ingresso elettroforesi (CC ad alta tensione): Tensione: 300 V CC Potenza: 15 W Corrente: 50 ma Ingresso luce del dock (CC a bassa tensione): Tensione: 18 V CC Corrente: 1,11 A Ingresso trasformatore della luce del dock (tensione linea CA): Tensione: VCA, Hz Corrente: 1,0 A Collegamenti elettrici: Alta tensione (elettroforesi): spinotti a banana retraibili e schermati Bassa tensione (luce): Jack da 2,1 x 5,5 x 14 mm Dock FlashGel Alimentazione a bassa tensione per la luce di visualizzazione Cavi ad alta tensione per elettroforesi Interruttore della luce Jack a bassa Supporto scientifico: scientific.support@lonza.com 5

7 Guida rapida al sistema FlashGel Punti importanti Non superare il volume di campione di 5 μl per linea per pozzetti e di cassette di pozzetti; o il volume di 12 μl per linea per cassette di pozzetti. Le concentrazioni di campione ottimali sono circa 1/5 della tipica concentrazione di banda di un gel di bromuro di etidio. Per risultati ottimali lavare i pozzetti del campione con acqua prima di caricarli e usare il colorante di caricamento FlashGel Loading Dye, i marcatori FlashGel Markers ed il tampone di recupero FlashGel Recovery Buffer. Quando si effettuano corse su cassette a doppia fila usare la maschera FlashGel. Quando si recuperano i campioni, usare i vetri di visualizzazione FlashGel. Istruzioni 1. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per la preparazione del campione e le condizioni di corsa consigliate. 2. Togliere i sigilli bianchi del pozzetto dalla cassetta. Non togliere i sigilli trasparenti di sfiato laterali. 3. Lavare i pozzetti del campione con acqua distillata o deionizzata. Inclinare la cassetta per spostare il liquido in eccesso sul bordo e tamponare assorbendo con un panno privo di pilucchi. Non tamponare direttamente i pozzetti. 4. Inserire la cassetta nel dock. Inserire la maschera FlashGel nella linea centrale dei pozzetti del campione se si utilizzano le cassette a doppia linea o le cassette di recupero. 5. Caricare i campioni. I campioni da recuperare vanno caricati nei pozzetti dei campioni della linea superiore. 6

8 6. Inserire i cavi di alta tensione, accendere l alimentazione e impostare la tensione consigliata. 7. Inserire l alimentazione a bassa tensione e accendere la luce. 8. Se si utilizzano cassette di DNA e RNA standard, eseguire la corsa per il tempo consigliato o fino a quando è completata la separazione dei frammenti desiderati. Se si utilizzano cassette di recupero, eseguire e osservare la migrazione del campione; prima che il campione desiderato raggiunga i pozzetti di recupero (2 a -linea) arrestare la corsa e disconnettere i cavi di alta tensione (completare i passi 9 13). 9. Eliminare per assorbimento la soluzione tampone in eccesso dal/i pozzetto/i di recupero e aggiungere 20 μl di tampone di recupero FlashGel Recovery Buffer. 10. Togliere la maschera FlashGel, collegare di nuovo i cavi di tensione e riavviare l alimentazione. Per osservare la migrazione di banda usare gli occhiali di visualizzazione FlashGel. 11. Quando la banda di interesse è migrata verso il centro del pozzetto di recupero, spegnere l alimentazione e scollegare i cavi di tensione. Usare una pipetta per rimuovere con cura il tampone di recupero (contenente il DNA) dal pozzetto di recupero. 12. Se necessario, il processo (aggiunta di soluzione tampone di recupero, elettroforesi, recupero) può essere ripetuto per aumentare il recupero di carichi di DNA più elevati. 13. Fotografare utilizzando la fotocamera FlashGel o un altra fotocamera standard e il transilluminatore. 7

9 Tabella 1 Preparazione consigliata del campione e condizioni della corsa Range di separazione Cassette di DNA Cassette di RNA Cassette di recupero 1,2%: 50 bp 10 kb 1,2%: 0,5 kb 9 kb 1,2%: 50 bp 10 kb 2,2%: 10 bp 1 kb La separazione di La separazione di frammenti > 4 kb frammenti > 4 kb verrà verrà migliorata migliorata facendo delle facendo delle corse corse più lunghe ad una più lunghe ad una tensione più bassa tensione più bassa Preparazione del campione Per risultati ottimali, diluire i campioni di DNA nel colorante di caricamento 1X FlashGel Loading Dye Campioni denaturati di DNA: Preparare i campioni in soluzione tampone di campione di formaldeide al 50% e acqua priva di RNasi; denaturare per 5 minuti a 65 C. Per risultati ottimali, diluire i campioni di DNA nel colorante di caricamento 1X FlashGel Loading Dye Concentrazioni del campione e limiti di rilevamento Tensione e tempo della corsa I livelli di carico ottimali del DNA sono 5-20 ng/banda in un carico di 5 μl; per risultati ottimali non superare 20 ng/banda Singola fila: 275 V per 2-7 minuti Doppia fila: 275 V per 2-5 minuti Campioni di RNA nativi: Utilizzare il colorante di caricamento FlashGel Loading Dye I livelli ottimali di carico dell RNA variano in base al campione di RNA; per risultati ottimali non superare 200 ng/banda in un carico di 5 μl Singola fila: 225 V per 4-8 minuti Doppia fila: 225 V per 3-5 minuti I livelli di carico ottimali del DNA sono ng/banda in volumi fino a 12 μl 275 V per il tempo necessario alle bande di elettroforesi per raggiungere i pozzetti di recupero varia in base alla dimensione dei frammenti da 3+ minuti Tempo massimo della corsa: minuti 8

10 Concentrazione e volume recuperati Marker raccomandati Cassette di DNA Cassette di RNA Cassette di recupero N/A N/A I recuperi del campione sono in genere dell 80-90%, in base al frammento I volumi di recupero in genere sono di μl cassette 1,2%: Marker Marker per RNA Marker per DNA per DNA FlashGel 100 FlashGel 0.5 kb 9 FlashGel 100 bp-3 bp 4 kb kb kb cassette 2,2%: Marker per DNA FlashGel 50 bp - 1,5 kb FlashGel QuantLadder 100 bp-3 kb Cassette a doppia fila: Marker per DNA FlashGel 100 bp - 3 kb 9

11 Istruzioni per il sistema FlashGel per DNA Introduzione Il sistema FlashGel è indicato per la separazione e l analisi rapida del DNA. Cassette di DNA FlashGel : Dimensionamento e quantizzazione di PCR o frammenti di restrizione da 10 bp 10 kb Conferma dell amplificazione PCR La separazione di frammenti di DNA può essere monitorata in tempo reale sul banco di laboratorio senza l uso dell illuminazione UV. I frammenti separati con il sistema FlashGel possono essere fotografati con la fotocamera FlashGel o altri sistemi standard di documentazione. Le cassette di DNA FlashGel non sono consigliate per il recupero. Utilizzare le cassette di recupero FlashGel (pagina 25) per il DNA da recuperare. Informazioni importanti Condizioni della corsa e risoluzione Il sistema FlashGel è progettato per una separazione rapida, ad alta tensione di frammenti da 10 bp a 10 kb. Le corse nelle cassette possono essere effettuate a tensioni più basse per tempi più lunghi per migliorare la separazione dei frammenti > 4 kb (pagina 18). Monitorare la corsa e ottimizzare le condizioni. I frammenti correranno più velocemente su un dock caldo. Se necessario ridurre il tempo della corsa o abbassare la tensione. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per le condizioni di corsa consigliate. Visualizzazione di bande sul dock FlashGel Le bande di DNA e del marker saranno visibili sul dock illuminato alla tipica illuminazione di laboratorio. Il grado di visibilità può variare in base all intensità complessiva della luce nel laboratorio. Le bande si possono visualizzare meglio osservandole direttamente sul dock in uno spazio che riduca al minimo l intensità della luce e il riflesso. In alternativa, la separazione di banda può essere visualizzata su uno schermo di computer con l ausilio di una fotocamera FlashGel. 10

12 Per garantire un idonea visibilità di un marker per la visualizzazione della corsa sul dock, usare i marker per DNA FlashGel oppure i FlashGel QuantLadders. Consultare la tabella 2 (pag. 14) e la figura 2 (pag. 16) per maggiori informazioni sulle concentrazioni di DNA visibili alle varie condizioni. Le bande di DNA sono visibili sul dock durante tutta la corsa. Colorante di caricamento e marker Il sistema FlashGel è compatibile con i coloranti di caricamento di gel e marker standard. Il colorante blu di bromofenolo non migra nelle cassette FlashGel ; tuttavia si possono usare i campioni contenenti blu di bromofenolo in quanto la migrazione dei campioni non ne è influenzata. Per risultati ottimali, usare il colorante di caricamento FlashGel Loading Dye ed i marker FlashGel o FlashGel QuantLadder. Preparazione del gel per la corsa Per ottenere risultati ottimali, usare una pipetta di travaso o un flacone da spruzzo per lavare i pozzetti con acqua distillata o deionizzata prima di caricare i campioni o i marker. Questo assicurerà un adeguata umidità nei pozzetti. Lavare i pozzetti, quindi inclinare la cassetta e usare un panno privo di pilucchi o un piccolo pezzo di carta assorbente per eliminare l eccesso di liquido dalla cassetta. Non tamponare direttamente i pozzetti. Livelli di sensibilità del DNA Il sistema FlashGel utilizza una colorazione esclusiva che è 5-20 volte più sensibile della colorazione di bromuro di etidio. In generale, usare concentrazioni di DNA per banda di 1/5 di quelle normalmente usate per il rilevamento del bromuro di etidio. Le concentrazioni ottimali di caricamento nelle cassette FlashGel sono di 5-10 ng di DNA per banda. Concentrazioni inferiori ai 5 ng per banda potrebbero non essere visibili sul dock; anche se concentrazioni inferiori a 0,10 ng per banda possono essere visualizzate utilizzando sistemi di rilevazione dati e foto di gel. Il limite massimo di visualizzazione è di 80 ng di DNA per banda; tuttavia, concentrazioni superiori ai 20 ng per banda possono risultare in una visualizzazione distorta della banda stessa. Le concentrazioni di DNA da caricare possono essere regolate per fornire immagini ottimali a seconda del sistema di analisi di immagine utilizzato. 11

13 A causa della sensibilità del sistema FlashGel, la maggior parte dei campioni di DNA va diluita ed il volume di carico per pozzetto non deve superare i 5 μl. Per risultati ottimali, diluire i campioni di DNA nel colorante di caricamento 1X FlashGel Loading Dye in modo tale che 5 μl di campione contengano 5-10 ng di DNA per banda. Istruzioni sulla corsa del gel ATTENZIONE. Durante la manipolazione delle cassette FlashGel indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione. 1. Preparare i campioni. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per la preparazione del campione consigliata. 2. Aprire la busta e togliere la cassetta. NOTA. Se la casetta è umida, asciugarla con un panno asciutto. NOTA. Fra il gel e la cassetta potrebbero essere presenti delle tasche d aria che non influenzeranno la migrazione della banda. 3. Collocare la cassetta su una superficie piatta e tirare la linguetta per rimuovere il sigillo bianco del pozzetto. Non togliere i sigilli trasparenti che ricoprono i fori di sfiato laterali. 4. Lavare tutti i pozzetti del campione con acqua distillata o deionizzata. Inclinare la cassetta e usare un panno privo di pilucchi o un piccolo pezzo di carta assorbente per togliere il liquido in eccesso. Non tamponare direttamente sui pozzetti. ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione non bagnare i pozzetti quando la cassetta è collegata all alimentazione ad alta tensione. 12

14 NOTA. Per risultati ottimali, lavare i pozzetti con AccuGENE Molecular Biology Water (Cat. n ). 5. Collocare la cassetta sul dock e farla scorrere in posizione; la cassetta dovrebbe scattare nel dock. 6. Caricare i campioni ed i marker. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per la preparazione del campione e i marker consigliati. ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione non caricare i campioni mentre la cassetta è collegata all alimentazione ad alta tensione. 7. Collegare l alimentazione a bassa tensione sul dock inserendo il cavo nella presa sul retro del dock e poi collegare l alimentazione. Questa è l alimentazione per la fonte luminosa. 8. Accendere la luce del dock premendo il pulsante arancione sulla parte alta dell unità. NOTA. La luce si spegnerà automaticamente dopo 10 minuti. Riavviare premendo il pulsante arancione. 9. Collegare i cavi dell alta tensione all alimentazione e impostare la corrente alla tensione consigliata (tabella 1, pag. 8-9). NOTA. Le correnti iniziali tipiche dovrebbero rientrare in un intervallo di ma per i gel di DNA. Far correre fino a quando si ottiene la separazione desiderata per i frammenti di interesse. Nelle condizioni descritte, i frammenti di DNA di 50 bp-100 bp migreranno fuori dal gel in 7-8 minuti. Consultare la figura 1 (pagina 15) per risultati di separazione a vari tempi di corsa. NOTA. L esecuzione di più cassette in rapida successione potrebbe richiedere una leggera regolazione delle condizioni di corsa poiché le bande vanno più veloci quando il dock diventa più caldo. Monitorare la separazione e ridurre la tensione e il tempo della corsa se necessario. NOTA. È normale una certa espressione di soluzione tampone dai pozzetti. 13

15 ATTENZIONE. Manipolare le cassette solo dopo aver spento la tensione e disinserito i cavi. 10. Far correre le cassette di DNA fino a quando si raggiunge la separazione desiderata per i frammenti di interesse. 11. Spegnere la tensione e scollegare i cavi dall alimentazione prima di togliere le cassette. 12. Registrare i dati del gel utilizzando una fotocamera FlashGel, mediante fotografia Polaroid, o mediante altri sistemi di cattura dell immagine. Vedere la figura 2 (pagina 16) per dettagli sulle fotocamere tipiche. Informazioni di riferimento Tabella 2. Quantità di DNA visibile sulle cassette di DNA FlashGel in varie condizioni Visualizzati in luce ambiente Visualizzati in camera oscura Frammento di 1500 Frammento di 400 bp bp 1,6 3,2 ng 1,6 3,2 ng 0,39 0,78 ng 0,39 0,78 ng Visualizzati con 0,10 0,20 ng 0,10 0,20 ng fotocamera FlashGel FlashGel Camera Photo 0,10 0,20 ng 0,10 0,20 ng Visualizzati con Dark 0, ng 0,10 0,20 ng Reader Transilluminatore Dark Reader Photo 0,10 0,20 ng 0,10 0,20 ng Visualizzati con UV 0,39 0,78 ng 0,39 0,78 ng UV Photo 0,39 0,78 ng 0,39 0,78 ng 14

16 Fig 1. Esempi di separazione a vari tempi di corsa a 275V su una cassetta di DNA FlashGel (1,2%, 12+1 fila singola di pozzetti) 2 minuti 4 minuti 6 minuti 8 minuti 10 minuti Linee campione da sinistra a destra: Linea 1. Marker per DNA FlashGel 100/200/300/500/800/1250/2000/4000 bp (5 μl carico, diluizione 1:5) Linea 2. FlashGel QuantLadder 100/250/400/500/1500 bp (5 μl carico, diluizione 1:5) Linea 3. Lonza Marker 50 bp 2500 bp (3 μl di carico, diluizione 1:5) Linea 4. Lonza Ladder 100 bp (3 μl di carico, diluizione 1:15 ) 15

17 Fig 2. Rilevamento di frammenti di DNA su cassette di DNA FlashGel Illuminare le cassette usando transilluminatori UV a luce azzurra, come ad esempio il transilluminatore Dark Reader. Fotografare con fotocamera FlashGel o con qualsiasi sistema usato per i gel standard colorati con bromuro di etidio Per il film Type 57 Polaroid con transilluminatore UV, iniziare con esposizioni di 1-2 secondi. Per sistemi CCD, usare il filtro di bromuro di etidio presente nel sistema. Il marker di DNA FlashGel (100 bp - 4 kb) viene caricato nell'ultima linea a destra. Le seguenti immagini presentano serie di diluizioni di frammenti di 400 bp e 1500 bp Transilluminatore Dark Reader con coperchio arancio, fotocamera CCD con filtro EtBr, esposizione di 3 secondi ,5 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 0,10 0,05 ng/linea Transilluminatore UV, fotocamera Polaroid con filtro EtBr, esposizione di 3 secondi ,5 6,25 3,13 1,56 0,78 0,39 0,20 0,10 0,05 ng/linea 16

18 Fig. 3. Separazione di marker e frammenti di DNA su una cassetta di DNA FlashGel (2,2%, doppia fila di pozzetti) Linee del campione: Linee 1, 7, 13: Marker FlashGel 50 bp 1 kb (consigliato per cassette 2,2%) Linee 2, 8, 14: Marker FlashGel 100 bp 3 kb (consigliato per cassette a doppia fila Linee 6 e 12: FlashGel QuantLadder Linee 3, 4, 5/9, 10, 11/15, 16, 17: carichi da 8 ng di frammenti di DNA di 150 bp, 600 bp e 800 bp 17

19 Fig. 4. Miglioramento della separazione di grandi frammenti di DNA sul sistema FlashGel 2 4 kb 3-10 kb 2 4 kb 3 10 kb Corse da 275 Volt Corse da 50 Volt Corse da 275 Volt Corse da 50 Volt 6 6 min 7 min 9,5 min 40 min 47 min 60 min 75 min 7 min 9,5 min 50 min 75 min Dimensioni dei frammenti: Dimensioni dei frammenti: 2000/2500/3000/4000 bp 3000/4000/5000/7000/10000 bp 18

20 Istruzioni per il sistema FlashGel per RNA Introduzione Il sistema FlashGel è indicato per la separazione rapida e l analisi di RNA, incluso: Verifica e analisi dell RNA totale 0,5 kb 9 kb Controllo della degradazione dell RNA Controlli rapidi dell RNA nativo I frammenti separati con il sistema FlashGel possono essere fotografati con la fotocamera FlashGel o altri sistemi standard di documentazione. Le cassette di RNA FlashGel non sono consigliate per il recupero. Informazioni importanti Condizioni della corsa e risoluzione Il sistema FlashGel è progettato per separazioni rapide ad alta tensione. Le cassette possono essere analizzate a tensioni più basse per tempi più lunghi per migliorare la separazione dei frammenti di peso molecolare più elevato. Monitorare la corsa e ottimizzare le condizioni. I frammenti correranno più velocemente su un dock caldo. Se necessario ridurre il tempo della corsa o abbassare la tensione. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per le condizioni di corsa consigliate. Visualizzazione di bande sul dock FlashGel Le bande di RNA e del marker saranno visibili sul dock illuminato alla tipica illuminazione di laboratorio. Il grado di visibilità può variare in base all intensità complessiva della luce nel laboratorio. Le bande si possono visualizzare meglio osservandole direttamente sul dock in uno spazio che riduca al minimo l intensità della luce e il riflesso. Le bande di RNA saranno visibili sul dock per i primi 3-4 minuti della corsa, quindi scompariranno e riappariranno dopo un periodo di continuazione post-corsa di > 10 minuti. Il marker di DNA FlashGel può essere utilizzato per monitorare la corsa dell RNA. Colorante di caricamento e marker Il sistema FlashGel per RNA è compatibile con i coloranti di caricamento di formaldeide standard e con i marker di RNA. Il colorante blu di bromofenolo non migra nelle cassette FlashGel ; 19

21 tuttavia si possono usare i campioni contenenti blu di bromofenolo in quanto la migrazione dei campioni non ne è influenzata. Per risultati ottimali utilizzare soluzione tampone di campione di formaldeide Lonza oppure colorante di caricamento FlashGel Loading Dye (per l RNA nativo), e marker di RNA FlashGel. Preparazione del gel per la corsa Per ottenere risultati ottimali, usare una pipetta di travaso o un flacone da spruzzo per lavare i pozzetti con acqua priva di RNasi prima di caricare i campioni o i marker. Questo assicurerà un adeguata umidità nei pozzetti. Lavare i pozzetti, quindi inclinare la cassetta e usare un panno privo di pilucchi o un piccolo pezzo di carta assorbente per eliminare l eccesso di liquido dalla cassetta. Non tamponare direttamente i pozzetti. Livelli di sensibilità dell RNA Il sistema FlashGel utilizza una colorazione esclusiva che è 5-20 volte più sensibile della colorazione di bromuro di etidio e rileverà quantità di RNA di <10 ng per banda. Per l RNA denaturato, diluire i campioni con soluzione tampone di caricamento di formaldeide in modo tale che un carico di 5 μl contenga < 200 ng di RNA per banda. Per l RNA nativo, diluire i campioni in colorante di caricamento FlashGel Loading Dye in modo tale che un carico di 5 μl contenga < 200 ng di RNA per banda. Istruzioni sulla corsa del gel ATTENZIONE. Durante la manipolazione delle cassette FlashGel indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione. 1. Preparare i campioni. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per la preparazione consigliata del campione. 2. Aprire la busta e togliere la cassetta. NOTA. Se la casetta è umida, asciugarla con un panno asciutto. 20

22 NOTA. Fra il gel e la cassetta potrebbero essere presenti delle tasche d aria che non influenzeranno la migrazione della banda. 3. Collocare la cassetta su una superficie piatta e tirare la linguetta per rimuovere il sigillo bianco del pozzetto. Non togliere i sigilli trasparenti che ricoprono i fori di sfiato laterali. 4. Lavare tutti i pozzetti del campione con acqua priva di RNasi. Inclinare la cassetta e usare un panno privo di pilucchi o un piccolo pezzo di carta assorbente per togliere il liquido in eccesso. Non tamponare direttamente i pozzetti. NOTA. Per risultati ottimali, lavare i pozzetti con AccuGENE Molecular Biology Water (Cat. #51200). ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione non bagnare i pozzetti quando la cassetta è collegata all alimentazione ad alta tensione. 5. Collocare la cassetta sul dock e farla scorrere in posizione; la cassetta dovrebbe scattare nel dock. ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione non caricare i campioni mentre la cassetta è collegata all alimentazione ad alta tensione. 6. Caricare i campioni ed i marker. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per la preparazione del campione e i marker consigliati. ATTENZIONE. Usare la maschera FlashGel per bloccare la luce dalla seconda fila dei pozzetti quando vengono usate le cassette di recupero a doppia fila. 7. Collegare l alimentazione a bassa tensione sul dock inserendo il cavo nella presa sul retro del dock e poi collegare l alimentazione. Questa è l alimentazione per la fonte luminosa. 8. Accendere la luce del dock premendo il pulsante arancione sulla parte alta dell unità. 21

23 NOTA. La luce si spegnerà automaticamente dopo 10 minuti. Riavviare premendo il pulsante arancione. 9. Collegare i cavi dell alta tensione all alimentazione e impostare la corrente alla tensione consigliata (tabella 1, pag. 8-9). NOTA. Le correnti di avvio tipiche dovrebbero essere di ma. Far correre fino a quando si ottiene la separazione desiderata per i frammenti di interesse. NOTA. L esecuzione di più cassette in rapida successione potrebbe richiedere una leggera regolazione delle condizioni di corsa poiché le bande vanno più veloci quando il dock diventa più caldo. Monitorare la separazione e ridurre la tensione e il tempo della corsa se necessario. NOTA. È normale una certa espressione di soluzione tampone dai pozzetti durante la corsa. 10. Far correre le cassette RNA per 8 minuti, quindi spegnere la tensione e scollegare i cavi dall alimentazione prima di togliere le cassette. ATTENZIONE. Manipolare le cassette solo dopo aver spento la tensione e disinserito i cavi. 11. Togliere la cassetta e lasciarla a temperatura ambiente per >10 minuti o fino a quando i frammenti sono visibili all intensità desiderata. L intensità massima viene raggiunta in circa 45 minuti. 12. Registrare i dati del gel utilizzando una fotocamera FlashGel, o mediante fotografia Polaroid, o con altri sistemi di cattura dell immagine. Fare riferimento alle figure 5 e 6 (pag ) per immagini RNA. 22

24 Informazioni di riferimento Fig. 5. Rilevamento di frammenti di RNA su cassetta di RNA FlashGel Corsa di una cassetta di 8 minuti a 225V; fotografata 20 minuti dopo la corsa. Linee del campione: Linee 1, 6, 11: Marker di DNA (per visualizzazione durante la corsa) Linee 2, 7, 12: Ladder di RNA di 100 ng Linee 3, 8, 13: 100 ng di RNA totale di E. coli (Ambion) Linee 4,9: ~100 ng di RNA totale di S. cervevisiae purificato con RiboPure Kit di lievito (Ambion) Linee 5, 10: 100 ng di RNA totale di timo di topo (Ambion) 23

25 Fig. 6. Rapido controllo di frammenti di RNA nativo su una cassetta di RNA FlashGel (1,2%, 12+1 fila singola) Corsa della cassetta per 4 minuti a 225V; seguita da una generazione dell'immagine immediata. Linee del campione: Linea 1: Marker Lonza, 50 ng Linea 2: RNA totale di E. Coli, 50 ng Linea 3: Marker Lonza, 250 ng Linea 4: RNA totale di E. Coli, 250 ng 24

26 Istruzioni per il sistema di recupero FlashGel Introduzione Il sistema di recupero FlashGel è consigliato per la rapida separazione e recupero di frammenti di DNA da 100 bp 4 kb. La separazione di frammenti di DNA può essere monitorata in tempo reale e i frammenti possono essere recuperati sul banco del laboratorio senza uso di illuminazione UV o necessità di escissione della banda. I frammenti separati con il sistema di recupero FlashGel sono compatibili con le applicazioni di biologia molecolare standard (amplificazione PCR, legazione e clonazione, ecc.) Informazioni importanti Condizioni della corsa e risoluzione Il sistema per recupero FlashGel è progettato per separazioni e recupero rapidi ad alta tensione. Le cassette possono essere analizzate a tensioni più basse per tempi più lunghi per migliorare la separazione dei frammenti più grandi. Monitorare la corsa e ottimizzare le condizioni per il frammento di interesse. I frammenti correranno più velocemente su un dock caldo. Se necessario ridurre il tempo della corsa o abbassare la tensione. Non superare un tempo di corsa totale di 14 minuti. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per le condizioni di corsa consigliate. Visualizzazione di bande sul dock FlashGel Le bande di DNA e del marker saranno visibili sul dock illuminato alla tipica illuminazione di laboratorio. Il grado di visibilità può variare in base all intensità complessiva della luce nel laboratorio. Le bande si possono visualizzare meglio osservandole direttamente sul dock in uno spazio che riduca al minimo l intensità della luce e il riflesso. Per garantire un idonea visibilità di un marker per il monitoraggio della corsa, usare i marker per DNA FlashGel oppure FlashGel QuantLadders. Consultare la tabella 2 (pag. 14) per informazioni sulle concentrazioni di DNA visibili a varie condizioni. Colorante di caricamento e marker Il sistema FlashGel è compatibile con i coloranti di caricamento di gel e marker standard. Il colorante blu di bromofenolo non migra 25

27 nelle cassette FlashGel ; tuttavia si possono usare i campioni contenenti blu di bromofenolo in quanto la migrazione dei campioni non ne è influenzata. Per risultati ottimali, usare il colorante di caricamento FlashGel Loading Dye ed i marker FlashGel o FlashGel QuantLadder. Preparazione del gel per la corsa Per ottenere risultati ottimali, usare una pipetta di travaso o un flacone da spruzzo per lavare i pozzetti con acqua distillata o deionizzata prima di caricare i campioni o i marker. Questo assicurerà un adeguata umidità nei pozzetti. Lavare i pozzetti, quindi inclinare la cassetta e usare un panno privo di pilucchi o un piccolo pezzo di carta assorbente per eliminare l eccesso di liquido dalla cassetta. Non tamponare direttamente i pozzetti. Per risultati ottimali, diluire il campione di DNA nel colorante di caricamento 1X FlashGel Loading Dye in modo che il campione (12 μl di carico massimo) contenga la quantità consigliata di DNA per banda. Livelli di sensibilità del DNA Il sistema FlashGel utilizza una colorazione proprietaria che è 5-20 volte più sensibile della colorazione di bromuro di etidio. In generale, usare concentrazioni di DNA per banda di 1/5 di quelle normalmente usate per il rilevamento del bromuro di etidio. Il livelli ottimali di carico del DNA sulle cassette di recupero FlashGel sono di ng per banda. I livelli di DNA possono essere regolati per fornire le migliori prestazioni per i frammenti di interesse. Elevati carichi di DNA potrebbero non fornire un adeguata risoluzione se il frammento di interesse è di dimensioni relativamente vicine a quelle di altri frammenti contaminanti. Recupero del DNA Per un efficacia di recupero ottimale (soprattutto per frammenti di DNA più grandi) aggiungere soluzione tampone di recupero FlashGel Recovery Buffer ai pozzetti di recupero prima di estrarre i frammenti di DNA. Per identificare condizioni ottimali per i frammenti recuperati utilizzare il frammento di controllo FlashGel Control Fragment fornito nella confezione di recupero FlashGel Recovery Starter Pack. 26

28 Risoluzione del DNA recuperato Per una risoluzione ottimale del DNA recuperato, diluire il campione da far scorrere sul gel successivo ad un rapporto minimo di 1:1 con acqua (ad es.: 2 ul di DNA recuperato, 2 ul di acqua, 1 ul di colorante di carico 5X FlashGel Loading Dye). Istruzioni per la corsa del gel ATTENZIONE. Durante la manipolazione delle cassette FlashGel indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione. 1. Preparare i campioni. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per la preparazione del campione consigliata. 2. Aprire la busta e togliere la cassetta. NOTA. Se la casetta è umida, asciugarla con un panno asciutto. NOTA. Fra il gel e la cassetta potrebbero essere presenti delle tasche d aria che non influenzeranno la migrazione della banda. 3. Collocare la cassetta su una superficie piatta e tirare la linguetta per rimuovere il sigillo bianco del pozzetto. Non togliere i sigilli trasparenti che ricoprono i fori di sfiato laterali. 4. Lavare entrambe le linee di pozzetti con acqua distillata o deionizzata. Inclinare la cassetta e usare un panno privo di pilucchi o un piccolo pezzo di carta assorbente per togliere il liquido in eccesso. Non tamponare direttamente i pozzetti. NOTA. Per risultati ottimali, lavare i pozzetti con AccuGENE Molecular Biology Water (Cat. #51200). ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione non bagnare i pozzetti quando la cassetta è collegata all alimentazione ad alta tensione. 5. Collocare la cassetta sul dock e farla scorrere in posizione; la cassetta dovrebbe scattare nel dock. Far scorrere la maschera 27

29 FlashGel Mask al suo posto sotto alla seconda fila di pozzetti per ridurre al minimo la luce che passa attraverso i pozzetti ed aumentare la visibilità mentre i campioni si separano. ATTENZIONE. Per evitare un esposizione accidentale all alta tensione non caricare i campioni mentre la cassetta è collegata all alimentazione ad alta tensione. ATTENZIONE. Usare la maschera FlashGel per bloccare la luce dalla seconda fila dei pozzetti quando vengono usate le cassette di recupero FlashGel. 6. Caricare i campioni ed i marker. Consultare la tabella 1 (pag. 8-9) per la preparazione del campione e i marker consigliati. NOTA. Per monitorare il recupero utilizzare il frammento di controllo FlashGel Control Fragment. 7. Collegare l alimentazione a bassa tensione sul dock inserendo il cavo nella presa sul retro del dock e poi collegare l alimentazione. Questa è l alimentazione per la fonte luminosa. 8. Accendere la luce del dock premendo il pulsante arancione sulla parte alta dell unità. NOTA. La luce si spegnerà automaticamente dopo 10 minuti. Riavviare premendo il pulsante arancione. ATTENZIONE. Manipolare o toccare le cassette solo dopo aver spento la tensione e disinserito i cavi. 9. Collegare i cavi dell alta tensione all alimentazione e impostare la corrente alla tensione consigliata (tabella 1, pag. 8-9). NOTA. Le correnti di avvio tipiche dovrebbero rientrare in un intervallo di ma. 28

30 NOTA. È normale una certa espressione di soluzione tampone dai pozzetti durante la corsa. Indossare guanti, camici e occhiali di sicurezza durante la manipolazione. 10. Lasciare che la corsa proceda, monitorando la migrazione dei campioni da recuperare. Immediatamente prima che i campioni desiderati raggiungano i pozzetti di recupero (2 fila), spegnere l alimentazione e scollegare i cavi ad alta tensione. Non togliere la cassetta dal dock. ATTENZIONE. Manipolare o toccare le cassette solo dopo aver spento la tensione e disinserito i cavi. 11. Eliminare per assorbimento il tampone in eccesso dai pozzetti di recupero e aggiungere 20 μl/pozzetto di soluzione tampone di recupero FlashGel Recovery Buffer. 12. Togliere la maschera FlashGel, ricollegare i cavi di tensione e accendere di nuovo l alimentazione. Per osservare la migrazione di banda del DNA usare gli occhiali di visualizzazione FlashGel. 13. Far correre fino a quando la banda da recuperare è entrata nel pozzetto di recupero, e il bordo frontale della banda si è spostato sul bordo anteriore del pozzetto di recupero. NOTA. Quando si recupera più di un frammento dal gel, iniziare a recuperare innanzitutto il frammento più piccolo. 14. Spegnere l alimentazione, scollegare i cavi e quindi usare una pipetta per rimuovere la soluzione tampone di recupero contente il DNA. ATTENZIONE. Durante la manipolazione delle cassette FlashGel indossare guanti, camice da laboratorio e occhiali di protezione. NOTA. la quantità recuperata non rappresenterà gli interi 20 μl caricati nel pozzetto. 15. Per il recupero di grandi quantità di DNA (>350 ng), potrebbe essere necessario ripetere il ciclo di elettroforesi-recupero per 29

31 poter recuperare il massimo di materiale di DNA. Se necessario, aggiungere altri 20 μl si soluzione tampone di recupero FlashGel Recovery Buffer ed avviare di nuovo la corsa fino a quando il campione è arrivato al bordo anteriore del pozzetto di recupero e quindi recuperarlo. Ripetere se necessario, facendo sempre attenzione a spegnere l alimentazione e a scollegare i cavi prima di recuperare i campioni. NOTA. La capacità tampone della cassetta di recupero FlashGel Recovery Cassette consentirà un supporto di ~12-14 minuti del tempo totale di corsa a 275V. Fare attenzione nel recupero di più frammenti o di frammenti eccezionalmente grandi per evitare un eccessivo tempo di corsa. 16. I recuperi di campioni possono essere valutati rapidamente mediante il sistema standard FlashGel per il DNA e il FlashGel QuantLadder. Preparare un campione di DNA recuperato combinando volumi uguali di DNA recuperato e acqua e quindi aggiungendo quantità appropriate di colorante di caricamento 5X FlashGel Loading Dye. Il volume del campione di DNA per il controllo di recupero dipende dalla quantità di DNA iniziale caricato sul gel di recupero. Valutare la quantità di DNA nel campione recuperato comparando rispetto alle bande nel FlashGel QuantLadder (tabella 3, pag. 31; Fig. 8, pag. 32). NOTA. In base alla quantità di tempo di corsa usato per la fase di recupero, la stessa cassetta FlashGel potrà essere utilizzata per controllare il campione recuperato. La cassetta sarà funzionale fino a ~ minuti del tempo di corsa totale a 275V. 30

32 Informazioni di riferimento Tabella 3. Livelli di DNA FlashGel QuantLadder Frammento Carico di 2,5 µl Carico di 5,0 µl 1500 bp 15 ng 30 ng 800 bp 10,5 ng 21 ng 400 bp 7,5 ng 15 ng 250 bp 3,75 ng 7,5 ng 100 bp 1,5 ng 3 ng Fig. 7. Immagini della cassetta di recupero FlashGel prima e dopo il recupero di un frammento di DNA di 1000 bp (carico di 300 ng) 31

33 Fig. 8. Recupero di frammenti di DNA di un intervallo di ampie dimensioni su cassetta di DNA FlashGel I campioni (100 ng) di frammenti di DNA sono stati separati e recuperati utilizzando il sistema di recupero FlashGel Recovery System. L immagine precedente illustra l analisi di aliquote di 3 μl di DNA recuperato con una cassetta di DNA FlashGel 1,2%. Linee del campione: Linea 1: FlashGel DNA Marker bp Linea 2: FlashGel QuantLadder (2,5 µl) Linea 3: frammento di DNA da 50 bp Linea 4: frammento di DNA da 200 bp Linea 5: frammento di DNA da 500 bp Linea 6: frammento di DNA da 1000 bp Linea 7: frammento di DNA da 2000 bp Linea 8: frammento di DNA da 4000 bp 32

34 Informazioni per gli ordini Sistema FlashGel Cat. N. Descrizione Misura/formato FlashGel Dock Una misura FlashGel Camera Una misura FlashGel System Comprende dock, fotocamera, scatola di 9 cassette di DNA, colorante di caricamento e marker Sistema FlashGel per DNA Cat. N. Descrizione Misura/formato FlashGel DNA Cassettes agarosio 1,2% formato 12+1 pozzetto a linea singola FlashGel DNA Cassettes FlashGel DNA Cassettes FlashGel DNA Cassettes FlashGel Loading Dye FlashGel DNA Marker 100 bp 4 kb FlashGel DNA Marker 50 bp 1,5 kb agarosio 1,2% formato 16+1 pozzetto a linea doppia agarosio 2,2% formato 12+1 pozzetto a linea singola agarosio 2,2% formato 16+1 pozzetto a linea doppia 5 fiale da 1 ml concentrazione 5X 500 μl Pronto per l uso Consigliato per cassette 1,2% Dimensioni di banda: 100/200/300/500/800/1250/2000/4000 bp 500 μl Pronto per l uso Consigliato per cassette 2,2% Dimensioni di banda: 50/100/150/200/300/500/800/1500 bp 33

35 Cat. N. Descrizione Misura/formato FlashGel DNA Marker 100 bp 3 kb FlashGel QuantLadder FlashGel DNA Starter Pack 500 μl Pronto per l uso Consigliato per cassette a doppia fila Dimensioni di banda: 100/300/500/800/1500/3000 bp 250 μl Pronto per l uso Dimensioni di banda: 100/250/400/800/1500 Include: dock FlashGel, scatola di 9 cassette di DNA 1,2%, agarosio formato 12+1 pozzetto a linea singola 1 ml FlashGel Loading Dye e 150 μl FlashGel DNA Marker Sistema FlashGel per RNA Cat. N. Descrizione Misura/formato FlashGel RNA Cassettes agarosio 1,2% formato 12+1 pozzetto a linea singola FlashGel RNA Cassettes Formaldehyde Sample Buffer FlashGel Loading Dye FlashGel RNA Marker AccuGENE Molecular Biology Water (DNase/RNase free) FlashGel RNA Starter Pack agarosio 1,2% formato 16+1 pozzetto a linea doppia Soluzione tampone di denaturazione dell RNA contenente blu di bromofenolo e xilene cianolo, 5 x 1 ml. Soluzione tampone di RNA nativo 5 fiale da 1 ml concentrazione 5X 0,5 bp 9 kb 50 µg (1 µg/ml) Per il lavaggio dei pozzetti del campione e diluizione dell RNA 1 L Include: Scatola di 9 cassette di RNA con agarosio 1,2%, formato

36 pozzetti a fila singola; soluzione tampone di campione di formaldeide; FlashGel RNA Marker; e AccuGENE Molecular Biology Water. Il dock viene venduto separatamente Sistema FlashGel per recupero Cat. N. Descrizione Misura/formato FlashGel Recovery agarosio 1,2% Cassettes formato 8+1 doppia fila FlashGel Recovery Buffer FlashGel Recovery Kit 2 fiale da 500 ml Include: Scatola di 9 cassette di recupero con agarosio 1,2%, formato pozzetti a doppia fila; FlashGel Loading Dye; FlashGel Recovery Buffer; FlashGel QuantLadder; FlashGel Control Fragment; FlashGel Visualization Glasses; FlashGel Mask. Il dock viene venduto separatamente Garanzia e responsabilità Questo prodotto è stato fabbricato applicando gli standard più elevati per materiali, mano d opera e progettazione. Lonza Rockland, Inc. garantisce che il prodotto è stato testato e sarà conforme o supererà le specifiche pubblicate. Questa garanzia è valida solo se il prodotto è stato messo in funzione e conservato conformemente alle istruzioni fornite. Lonza Rockland, Inc. garantisce che questo prodotto è privo di difetti nei materiali e nella mano d opera nelle normali condizioni di servizio per un (1) anno dalla data di consegna. Se il prodotto presentasse dei difetti durante questo periodo, Lonza Rockland, Inc., riparerà o sostituirà a suo giudizio senza spese aggiunte il prodotto, se reso con spese postali prepagate. Questa garanzie non copre: danni di trasporto, danni causati da trascuratezza, uso errato o negligenza, normale usura da un utilizzo frequente, danni causati da corrosione di solventi, danni causati da una manipolazione non corretta o da modifiche effettuate dall utente, prestazioni non soddisfacenti quale risultato di condizioni fuori dal controllo di Lonza Rockland, Inc. Lonza Rockland, Inc., in nessun caso sarà responsabile di danni accidentali o derivati, inclusi non esaustivamente, perdita di profitti, perdita di reddito, perdita di opportunità commerciali, perdita dell utilizzo e altri danni correlati causati in qualsiasi modo e qualsiasi danno che possa sorgere dall uso non corretto del prodotto. 35

37 Informazioni sulla licenza e sul marchio Alcuni componenti e tecnologie del sistema FlashGel sono venduti con contratti di licenza. La colorazione dell acido nucleico in questo prodotto è fabbricata e venduta in licenza da Molecular Probes, Inc.; la cassetta FlashGel viene venduta in licenza da Invitrogen IP Holdings, Inc. e il suo utilizzo è limitato esclusivamente in ambito di ricerca o di controllo qualità e è coperta da brevetti registrati ed in corso di registrazione. Dark Reader è un marchio registrato di Clare Chemical Research, Inc. La tecnologia FlashGel Dock contiene la tecnologia del transilluminatore Clare Chemical Research, Inc. Dark Reader ed è protetta dai brevetti statunitensi 6,198,107; 6,512,236; e 6,914,250. La tecnologia di elettroforesi è concessa in licenza dalla Temple University ed è protetta da brevetto statunitense 6,905,585. Polaroid è un marchio di fabbrica di Polaroid Corporation. RiboPure è un marchio registrato di Ambion, Inc. Tutti gli altri marchi sono marchi di Lonza Group e delle sue associate. Solo ad uso di ricerca. Da non usarsi per procedure diagnostiche Lonza Rockland, Inc. Lonza Rockland, Inc. scientific.support@lonza.com Supporto scientifico: Servizio clienti: Documento n Rockland, ME

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