Definizione di genoteca (o library) di DNA

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1 Definizione di genoteca (o library) di DNA Collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio. Possono essere di DNA genomico o di cdna. Libreria genomica: collezione di cloni che include tutto il DNA genomico di una certa specie Libreria di cdna: collezione di cloni che include tutte le specie di mrna (trascritte in cdna) espresse in un dato tessuto, incluso quelle piu rare 2 CONCETTI GENERALI IMPORTANTI Rappresentatività: una libreria si dice rappresentativa quando contiene, in almeno una copia, tutte le possibili sequenze Ridondanza: una libreria si dice ridondante quando contiene molte copie di alcune sequenze, complicando la ricerca e selezione (screening) della sequenze che vogliamo analizzare 1

2 FASI GENERALI PER LA COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA GENOMICA 1- Frammentazione del genoma (Digestione con endonuclesi di restrizione, Frammentazione meccanica) 2- Ligazione con il vettore (Ligazione con estremità coesive, estremità piatte) 3- Introduzione nella cellula ospite (Trasformazione con DNA plasmidico ricombinante, Trasfezione con DNA fagico, Impacchettamento in vitro capsidi fagici) 4- Screening dei cloni di interesse (Ibridazione, PCR) Preparazione dei frammenti da clonare a) Digestione parziale con endonucleasi di restrizione Se si utilizza un enzima di restrizione con un sito di riconoscimento di 6bp (EcoRI), i frammenti generati avrebbero dimensioni in media di 4x10 3 bp, se la composizione in basi del DNA fosse casuale. In realtà i frammenti che si ottengono sono troppo grandi o molto piccoli e questi sarebbero più rappresentati nella library. Una strategia comunemente usata è quella di digerire il genoma con un enzima che taglia siti a 4 basi (Sau3A, AluI, HaeIII), avendo cura di effettuare la digestione in condizioni tali che la digestione sia parziale (tempi di digestione o quantità di enzima sub-ottimali). Le digestioni parziali di un genoma garantiscono la produzione di una collezione di cloni sovrapposti. 2

3 b) Frammentazione DNA (metodi fisici) E possibile frammentare il DNA con metodi fisici, come la sonicazione, o il passaggio attraverso un sottile ago di una siringa, oppure meccanicamente (vortex) Questi metodi presentano il vantaggio di produrre frammentazioni casuali (maggiore rappresentatività), ma lo svantaggio di produrre frammenti sia con estremità blunt che con estremità 5 e 3 sporgenti, non adatte alla ligazione, che devono essere rese blunt. Adattatori!!!! 3

4 Costruzione di librerie genomiche Librerie cdna Preparazione del cdna 4

5 Librerie cdna basate su PCR Clonaggio direzionale del cdna Utilizzando oligonucleotidi modificati che inseriscono siti unici di restrizione ad entrambe le estremità del cdna a doppio filamento è possibile ottenere il clonaggio direzionale nel vettore scelto Librerie cdna classiche La sintesi del cdna produce, a partire da molecole di messaggero uguali, molecole di DNA di diversa lunghezza. Sovra-rappresentazione del 3 se la sintesi è innescata da oligo-dt 3 5 cdna 1 (full-lenght) mrna TTTTTTTT 5 AAAAAAAA cdna 1-2 TTTTTTTT 5 AAAAAAAA cdna 1-3 TTTTTTTT 5 AAAAAAAA cdna 1-4 TTTTTTTT 5 AAAAAAAA 3 5

6 Questo inconveniente può essere superato utilizzando random primer al posto dell oligo dt per la sintesi del cdna. Costruzione di librerie cdna Per il clonaggio del cdna sono aggiunti alle estremità piatte del cdna degli adattatori in modo da rendere le molecole di cdna compatibili con il vettore scelto. 6

7 Vettori usati per librerie genomiche e cdna Batteriofago λ Plasmidi Cosmidi Cromosomi artificiali di batteri (BAC) Cromosomi artificiali di lievito (YAC) Plasmidi Ø Derivano da elementi presenti in natura Ø permettono di clonare frammenti fino a bp libreria conservata in E.coli APPLICAZIONI. Librerie cdna e Librerie shotgun 7

8 Batteriofago λ (lamda) È costituito da 2 componenti principali che sono il capside/parti proteiche costitutive e DNA genoma Ciclo litico e lisogenico del batteriofago λ Il batteriofago λ è caratterizzato dalla presenza dei siti cos estensione a singolo filamento di 12 nucleotidi complementari tra loro che permettono al DNA genomico di circolarizzare una volta entrato nel batterio ospite 8

9 Il sistema lisogenico e la ricombinazione sito specifica. Ø DNA del virus ingegnerizzato (vengono utilizzati batteriofagi che attuano il ciclo litico e non quello lisogenico) Mappa del genoma di λ Ø Sono costituiti da DNA double-stranded lineare della lunghezza di 45 kb con un braccio dx ed uno sx sui quali sono presenti i geni per il ciclo litico Braccio sx DNA dispensabile Braccio dx Ø Hanno siti di taglio per l inserimento del DNA Ø Si riescono a clonare frammenti di bp 9

10 Digestione del DNA fagico Sito cos Sito di taglio bp Sito di taglio Sito cos Braccio sx DNA dispensabile eliminato DNA dispensabile kb Braccio dx Ligazione del DNA esogeno bp DNA da clonare kb Vettore ricombinante da usare per la fase successiva di packaging Struttura di due vettori di sostituzione λ EMBL3 e EMBL4 in commercio 10

11 21/11/14 Impacchettamento DNA λ (Packaging) Naturale processo di impacchettamento (packaging) del DNA genomico di λ Impacchettamento (packaging) in vitro dei concatameri di λ in presenza della miscela di 2 estratti di E.coli I concatameri da circa 45 kb (braccio dx + DNA genomico/ cdna + braccio sx) con a monte e a valle i siti cos vengono efficacemente impacchetati nella struttura fagica 11

12 Packaging in vitro Infezione e recupero lisato libreria conservata in fagi λ Sito cos Sito cos ospite APPLICAZIONI.. Librerie cdna e Librerie genomiche 12

13 Cosmidi Ø Non derivano da elementi presenti in natura a differenza dei plasmidi e dei fagi, ma derivano dalla combinazione delle caratteristiche dei plasmidi e dei fagi Ø Plasmidi che contengono un frammento di DNA del fago λ con all interno il sito Cos Ø permettono di clonare frammenti fino a bp Ø Plasmidi è piccolo rispetto alle braccia del fago libreria conservata in E.coli APPLICAZIONI.. Librerie genomiche ospite 13

14 Cromosomi Artificiali Batterici (BAC) Struttura di un BAC (geni oris e repe garantiscono la replicazione unidirezionale, para e parb controllano il n di copie del vettore, CmR marcatore per resistenza al cloranfenicolo, cosn e loxp siti di taglio per terminasi λ e proteina cre, HindIII e BamHI Sono dei cromosomi artificiali costituiti da: Gene lacz (7 Promotore T7/SP6 (6 sito lox p (5 3) para, B, C controllo del numero di copie sito cos N (4 8) siti di restrizione multipli 9) marcatore selettivo per la resistenza ad un antibiotico 1) ori per i batteri 2) repe controllo della replicazione Ø possono essere clonati frammenti di DNA da bp 14

15 ospite libreria conservata in E.coli APPLICAZIONI.. Librerie genomiche Cromosomi Artificiali di Lievito (YAC) Sono dei cromosomi artificiali costituiti da: marcatore selettivo indipendenza da triptofano ed uracile siti di sequenza restrizione centromerica multipli telomeri TEL ori per i batteri TRP1 ori per i lieviti ARS BRACCIO SX CEN URA3 BRACCIO DX TEL Ø possono essere clonati frammenti di DNA da bp Ø La loro stabilità è tanto maggiore quanto più grandi sono gli inserti clonati (contrariamente a quanto succede per fago, cosmidi e BAC) 15

16 ospite libreria conservata in S. cerevisiae Screening di una genoteca 1 Una volta che si sono collezionati centinaia di migliaia di frammenti di DNA in una biblioteca genomica o a cdna, come si fa a trovare il gene che si vuole studiare? È come cercare un ago in un pagliaio

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18 Risultati attesi dallo screening di librerie cdna/genomiche Applicazioni ü Librerie cdna: sequenza dell mrna (5 e 3 UTR), possibili varianti di splicing ü Librerie genomiche: introni, esoni, regioni regolative (promotore/enhancer) ü Librerie genomiche: associazione del nostro gene con altri nella stessa regione cromosomica ü Mappatura fisica dei cloni genomici sui cromosomi (in situ) ü Correlare il clone isolato con regioni cromosomiche associate a caratteri di interesse per il miglioramento genetico (resistenze, controllo fenomeni biologici importanti es. fioritura, produttività etc) 18