La degradazione ossidativa di zuccheri, ac. grassi, e amminoacidi. livello del substrato) Equivalenti riducenti di NADH e FADH 2

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1 La degradazione ossidativa di zuccheri, ac. grassi, e amminoacidi produce energia: ATP (fosforilazioni a livello del substrato) Equivalenti riducenti di NADH e FADH 2 Dalla loro ri-ossidazione si può ottenere l energia necessaria alla sintesi di ATP. La ri-ossidazione degli equivalenti riducenti di NADH e FADH 2 avviene a carico della catena di trasporto degli elettroni mitocondriale localizzata nella Membrana mitocondriale interna (eucarioti) o nella Membrana plasmatica (procarioti) FOSFORILAZIONE OSSIDATIVA

2 D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA 2/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007

3 NADH e FADH 2 si riossidano trasferendo gli e- a centri redox organizzati in complessi multiproteici transmembrana, o integrali, localizzati nella membrana mitocondriale interna Lo scopo della catena di trasporto degli elettroni è quello di creare un potenziale energetico sufficiente a permettere la sintesi di molecole di ATP

4 Complesso I NADH-deidrogenasi Complesso II Succinato-deidrogenasi (FADH 2 ) I centri redox trasferiscono gli elettroni spontaneamente e ogni reazione redox risulta esoergonica Complesso III: Citocromo C- Ubichinolo-ossidoreduttasi Complesso IV Citocromo C-ossidasi I centri redox sono disposti in ordine di potenziali di riduzione crescenti +0,82 Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2007

5 Complessi della catena di trasporto degli elettroni D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

6 La sequenza dei trasportatori lungo la membrana interna mitocondriale non è casuale: sono disposti secondo un ordine di potenziale di riduzione (E 0 ) crescente, che garantisce un processo redox globalmente esoergonico NADH + H + + ½ O 2 NAD + + H 2 O ΔG 0 complessivo = -nfδe 0 = -2(96.5)[0.82-(-0.32)] = -220 KJ/mol

7 CENTRI REDOX DEL COMPLESSO I: FMN CENTRI FERRO-ZOLFO UBICHINONE H: - + H + D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA 2/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007

8 CENTRI Fe-S (è lo ione ferro che trasferisce l e - cambiando stato di ossidazione: Fe 3+ > Fe 2+ ) Fe-S Fe 2 -S 2 Fe 4 -S 4 Indipendentemente dal n di ioni Fe ogni centro FeS differisce dall altro per una sola carica formale: quando sono presenti 2 o più ioni Fe, essi costituiscono un sistema coniugato che accoglie o rilascia 1 SOLO e-. D. Voet, J.G. Voet, C.W. Pratt, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA 2/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007

9 COMPLESSO I (14>>45 componenti proteiche) (NADH-deidrogenasi o NADH:ubichinone ossidoreduttasi) H: NADH + H + + FMN - + H + NAD + + FMNH 2 1 :H - trasferito sull FMN FMNH 2 + Fe +3 S 1H + 1e - FMNH + Fe +2 S 1 e- è trasferito sul Fe 3+ 1 H + è rilasciato nella matrice 1H FMNH + Fe +3 S + 1e - FMN + Fe +2 S 1 e- è trasferito sul Fe 3+ 1 H + è rilasciato nella matrice FMNH 2 cede i 2 elettroni 1 alla volta ai centri Fe-S e rilascia 2 H + alla matrice Il NADH proviene dai cicli ossidativi Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

10 1e - FMNH 2 Alla matrice I centri Fe-S trasportano solo e - e solamente 1 alla volta. Sono presenti 8/9 centri Fe-S (2 Fe-S e 7 4Fe-4S) che hanno potenziali di riduzione crescenti e sono disposti in sequenza (trasferimento ESOERGONICO). Costituiscono un canale per gli e - e li indirizzano all accettore finale: UBICHINONE Dalla matrice 2 H + 1e - 2 H+ Si dirige al complesso III CoQH 2 CoQ D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

11 4H + vengono traslocati nello spazio intermembrana per ogni NADH che è ossidato Si dirige al complesso III solubilizzandosi nel doppio strato fosfolipidico I cambiamenti conformazionali indotti dalla variazione dello stato di ossidazione del complesso proteico (dal flusso spontaneo di e - ) attivano il POMPAGGIO DI PROTONI. Cambiano i pka di catene laterali di residui amminoacidici che costituiscono la porzione transmembrana: gli ioni H + saltano da un gruppo all altro fino a che non vengono rilasciati all esterno.

12 COMPLESSO II (4 subunità proteiche e 5 gruppi prostetici) (Succinato deidrogenasi o Succinato:Ubichinone ossidoreduttasi) Enzima coinvolto nel ciclo di Krebs, catalizza l ossidazione del succinato a fumarato a carico del FAD. Verso il complesso III QH 2 Il FADH 2 trasferisce i 2e - 1 alla volta al centro 2Fe-2S, e 2 H + nella matrice. Attraverso i centri Fe-S gli e - giungono all ubichinone (Q) che si riduce a Ubichinolo (QH 2 ) accettando anche 2 H + dalla matrice. 2H + 2e - Succinato + FAD Fumarato + FADH 2 Il complesso II non è associato ad una pompa protonica, d altra parte, la reazione redox che avviene non libererebbe energia sufficiente ad attivare la traslocazione di H + Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

13 Nel complesso II è presente anche un gruppo eme b che protegge dalla formazione di specie reattive dell O 2 (ROS): acchiappa e - in fuga D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

14 La formazione di radicali liberi dell O 2 è frequente durante il trasporto di e -. Sono però vari i meccanismi di difesa dalle specie reattive dell O 2 (ROS). ossidato ridotto Nelson-Cox, I principi di Biochimica di Leningher 5/E, Zanichelli Ed. S.p.A. Copyright 2010 Altri agenti antiossidanti oltre al glutatione sono l ac. Ascorbico, le vitamine E, A che agiscono come trappole di radicali liberi.

15 SPECIE REATTIVE DELL OSSIGENO (ROS) PEROSSIDAZIONE LIPIDICA ACCUMULI DI AGGREGATI COVALENTI DI LIPIDI AUMENTO PERMEABILITA DELLA MEMBRANA OSSIDAZIONE DI PROTEINE FRAMMENTAZIONE DI PROTEINE AGGREGAZIONE DI PROTEINE MUTAZIONI A CARICO DEL DNA NUCLEARE E MITOCONDRIALE

16 SISTEMA DI PROTEZIONE DAI ROS GLUTATIONE-DIPENDENTE Glutatione (GSH): tripeptide, sequestra agenti ossidanti, protegge le cellule da danni causati da elevate concentrazioni di perossidi, ha un importantissima azione intra- e extra-cellulare di difesa dallo stress ossidativo Legame isopeptido fra il γ-cooh del glutammato e l α-nh 2 della cisteina α β γ GLUTATIONE (GSH) ridotto

17 Dimerizza per ossidazione 2e, 2H + Ponte disolfuro GLUTATIONE (GSSG) OSSIDATO

18 Ciclo redox del glutatione Anione superossido 4. O - 2 SOD Superossido dismutasi 2O 2 + 2H 2 O 2 4H + Deve essere ridotto 2H 2 O + O 2 È importante mantenere nella cellula il glutatione nello stato ridotto GSH, perché possa rispondere all aumentato livello dei perossidi 2x GSH GPx Glutatione perossidasi: trasferisce 2 e - dal GSH all H 2 O 2 IL GSH SI OSSIDA A GSSG Glutatione reduttasi: trasferisce al GSSG 2 e - e 1 H + provenienti dal NADPH, e 1 H + dal mezzo, GR H + GSSG NADPH NADP + NADH NAD + NADP + /NADH Trans-Idrogenasi

19 L ubichinone o coenzima Q rappresenta il punto di raccolta degli e - provenienti dai processi ossidativi catabolici. Sistema navetta glicerolo 3-fosfato (elettroni liberati dalla glicolisi) (ETF) Flavoproteina trasportatrice di e - β-ossidazione acidi grassi: si producono equivalenti riducenti di FADH 2

20 COMPLESSO III (11 componenti) (Ubichinolo:citocromo c ossidoreduttasi) x 2 x 2 x 2 Subunità principali: Citocromo b (2 gruppi eme: b H e b L ) Citocromo C1 (1 gruppo eme c 1 ) ISP (1 centro 2Fe-2S) citocromo c 1 Eme c 1 cit c contiene 1 centro 2Fe-2S in cui il Fe è coordinato anche da residui di His Citocromo C = accettore finale di e - È una subunità mobile e solubile, nello stato ossidato si associa al complesso sul lato esterno. citocromo b I citocromi hanno come gruppo prostetico dei gruppi eme che coordinano uno ione Fe 3+ = centro redox adibito al trasferimento di elettroni Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

21 Fe-protoporfirina IX (citocromi b, Hb, Mb) Eme c (citocromi c) legato alla proteina con legami tioeteri Eme a (citocromi a) Suddivisi in base allo spettro di assorbimento della luce. Hanno potenziali di riduzione differenti (a seconda delle interazioni stabilite dal Fe con i residui amminoacidici della proteina)

22 Nel complesso III giungono tutte le molecole di QH 2 provenienti: - dal complesso I, - dal Complesso II, - dal sistema navetta glicerolo fosfato/diidrossiacetone-fosfato, - e dalla beta-ossidazione degli acidi grassi. Ogni QH 2 che arriva al complesso III si ri-ossida introducendo 2 e- nel ciclo Q Ogni 2 QH 2 che si ri-ossidano nel ciclo Q, se ne riforma un altro nel complesso III. Ogni 2 QH 2 che si ri-ossidano nel ciclo Q 2e- sono trasferiti su 2 citocromi C e 4 H + sono traslocati nello spazio intermembrana.

23 Ossidazione del QH 2 nel complesso III: CICLO Q A) 1 a molecola di QH 2 si lega vicino all eme b L : rilascia 2 elettroni e si ossida a Q liberando 2H + nello spazio intermembrana 1e - Eme b L Eme b H Q 1e - ISP (Fe 2 -S 2 ) Eme c 1 Cit c B) 2 a molecola di QH 2 : rilascia 2 elettroni e si ossida a Q liberando 2H + nello spazio intermembrana e - dalla matrice H + QH 1e - Eme b L Eme b H QH QH 2 e - Complesso IV Rimane legato nel complesso dalla matrice 1e - ISP (Fe 2 -S 2 ) Eme c 1 Cit c Complesso IV H + Rilasciato

24 COMPLESSO IV: CENTRI REDOX Subunità II = 1 centro redox: Cu A (centro binucleare a 2 atomi di rame legati a due residui di cisteina, formano una struttura geometrica simile a quella di un centro FeS) riceve e - dal CytC rid Subunità I = 3 centri redox: Eme a (Fe 3+ ) Eme a 3 (Fe 3+ ) Cu B Centro binucleare FeCu Riduce l O 2 D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2013 La Tyr 244 partecipa al trasferimento degli e - all O

25 COMPLESSO IV (13 subunità) (citocromo c ossidasi) Catalizza l ossidazione del citocromo c e la riduzione dell O 2 ad H 2 O 2 e- trasferiti da 2 Cyt. C al CuA. Dal CuA arrivano sull Eme a. Dall Eme a arrivano sul centro binucleare FeCu (CuB) e quindi all OSSIGENO. 2H + 2xCytC 2x e - Il passaggio di 2e - (uno alla volta) attraverso i centri redox libera energia sufficiente da attivare una canale protonico e traslocare 2H + nello spazio intermembrana ½ O 2 2H + 2H + 1 H 2O Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

26 2 e- riducono ½ O 2 ad 1 H 2 O. Per ridurre completamente 1 O 2 a 2 molecole di H 2 O occorre che arrivino 4 Cyt-C (4 e-). O 2 Eme a CuA Eme a3 CuB 2 H 2 O CuB Eme a3 Eme a3 CuB Ogni volta che 4 e- fluiscono nel complesso IV, 4 H + sono traslocati fuori dal mitocondrio. Berg et al., BIOCHIMICA 6/E, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2007

27 Per ogni NADH che si riossida nel complesso I, la catena di trasporto degli e - trasloca 10 H + nello spazio intermembrana, per ogni FADH 2 riossidato sono traslocati 6 H +. 1NADH >>>> 10 H + out >>>> ½ O 2 H 2 O (4 H + out dal Compl. I 4 H + out dal Compl. III 2 H + out dal Compl. IV) e- e- e- e- 1 FADH 2 >>>> 6 H + out >>>> ½ O 2 H 2 O (4 H + out dal Compl. III 2 H + out dal Compl. IV) Riduzione completa di O 2 2NADH >>>> 20 H + out >>>> O 2 2H 2 O Riduzione completa di O 2 2FADH 2 >>>> 12 H + out >>>> O 2 2H 2 O Trasferimento di 4 e -

28 I complessi I, III e IV generano un gradiente protonico che è sia un gradiente di concentrazione [H + ] sia un gradiente elettrico. L energia libera rilasciata dalle reazioni redox lungo la catena di trasporto degli e- viene immagazzinata come FORZA MOTRICE PROTONICA (teoria chemiosmotica di Mitchell) Spazio intermembrana + - Matrice A cavallo della membrana mitocondriale interna si stabilisce una differenza di potenziale elettrochimico (differenza di carica e di ph) La differenza di ph = unità La diferenza di potenziale di membrana = ,20 V D. Voet C. W. Pratt J. G. Voet, FONDAMENTI DI BIOCHIMICA, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

29 FORZA MOTRICE PROTONICA ΔG 0 = -220 Kj/mol I protoni sono spinti a rientrare nella matrice secondo gradiente e ciò rende disponibile energia libera che viene utilizzata per la sintesi di ATP e- e- e- e Complesso V La membrana mit. Interna è impermeabile ai protoni. La porta d accesso verso la matrice per i protoni è il canale protonico dell ATP-sintasi (Complesso V), l enzima che sintetizza ATP. Nelson Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER, Zanichelli editore S.p.A. Copyright

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