Dott. Elena Niccolai, PhD. Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica Università degli Studi di Firenze

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Leona Giorgi
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1 Dott. Elena Niccolai, PhD Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica Università degli Studi di Firenze Premio Gianfranco Del Prete per le malattie orfane, Firenze 8 novembre 2014

2 ADENOCARCINOMA PANCREATICO (AP) Quinta causa di morte per cancro nel mondo Tra i tumori dell apparato digerente, rappresenta la neoplasia più letale, con una sopravvivenza media di 4-6 mesi dalla diagnosi Solo il 20% dei pazienti con AP presenta una malattia potenzialmente suscettibile di resezione chirurgica alla diagnosi e la sopravvivenza globale, dopo 5 anni dalla chirurgia, non supera il 20%. le terapie oggi a disposizione per il trattamento del AP risultano scarsamente efficaci: fondamentale lo studio di nuovi approcci terapeutici mirati. IMMUNOTERAPIA SPECIFICA

suscettibile di resezione chirurgica alla diagnosi e la sopravvivenza globale, dopo 5 anni dalla chirurgia, non supera il 20%.

3 Immunità e tumori IMMUNOTERAPIA SPECIFICA Rivelare antigeni tumorali Aumentare Qualità e Quantità di cellule immuni effettrici Eliminare i meccanismi immunosoppressivi del cancro

4 Linfociti T e Tumori Linfociti T CD8 + Linfociti T CD4 + Attività citolitica diretta: IFN-γ e TNF-α perforino-mediata Fas/Fas-L Attività helper Attività citotossica diretta (IFN-γ e TNF-α, perforino-mediata; Fas/Fas-L mediata)

perforino-mediata Fas/Fas-L Attività helper Attività

5 Differenziazione linfociti T CD4 +

6 Antigeni associati a AP La selezione dell appropriato antigene tumore associato è essenziale per indurre risposte immunitarie forti e complete (sia umorali sia cellulari) in grado di arrestare la progressione del cancro nei pazienti Negli ultimi anni identificati molti antigeni associati al AP, (es. MUC1, Kras, la proteina coactosin-like ) ma, finora, il loro uso in terapia si è dimostrato inefficace recente scoperta dell α-enolasi (ENOA), antigene sovraespresso a livello del AP ed in grado di innescare risposte immuni nei pazienti (Cappello P et al. Int J Cancer 2009)

7 α-enolasi (ENOA): nuovo antigene tumore associato? Enzima glicolitico ubiquitario multifunzionale. Si trova sovraespresso sulla superficie di molte cellule cancerose, fra cui quelle pancreatiche (Cappello et al. Int J Cancer 2009) Sulla membrana cellulare agisce da recettore per il plasminogeno, meccanismo che lo vede coinvolto nella migrazione delle cellule neoplastiche (Cappello et al. FEBS J 2011) È in grado di suscitare risposte immuni sia umorali che cellulomediate; la presenza di autoanticorpi anti-enoa si associa ad una prognosi migliore (Tomaino et al. J Proteome Res 2011) In modelli murini di cancro pancreatico, la vaccinazione con ENOA si è dimostrata capace di ritardare la progressione tumorale e di allungare il tempo di sopravvivenza dei topi (Cappello et al. Gastroenterology 2013)

Int J Cancer 2009) Sulla membrana cellulare agisce da recettore per il plasminogeno, meccanismo che lo vede coinvolto nella migrazione delle cellule neoplastiche (Cappello et al.

8 Scopo dello studio Valutare se ENOA è in grado di innescare una risposta T specifica in pazienti con AP Studiare le caratteristiche (protettive o protumorali) delle cellule immunitarie T ENOAspecifiche infiltranti il tumore

Studiare le caratteristiche (protettive o protumorali)

9 15 pazienti affetti da adenocarcinoma pancreatico duttale (età media 63 anni) Prelevati frammenti di mucosa pancreatica provenienti dalla regione centrale del tumore (CT), dalla regione a margine del tumore (MT) e dalla circostante mucosa sana (HS) TIL (Tumor Infiltrating Lymphocytes) Clonazione ad alta efficienza 10 giorni 15 giorni IL-2 50U/ml Cloni T

dalla regione a margine del tumore (MT) e dalla circostante mucosa sana (HS) TIL (Tumor

10 Caratteristiche dei pazienti e progenie clonale ottenuta Paziente Età Sesso TNM Cloni linfocitari T ottenuti PP 50 M pt3, N1, Mx 84 MR 73 M pt4, N1, Mx 26 PR 56 M pt3, N0, Mx 6 PT 36 M pt2, N1, M1 16 NN 74 F pt3, N1, Mx 91 ME 61 F pt2, N1, Mx 20 DA 63 M pt3, N1, Mx 37 RA 74 F pt3, N0, Mx 74 MM 54 F pt3, N0, Mx 5 PL 92 M pt3, N1, Mx 3 CM 57 M pt2, N1, M1 22 RA 51 F pt4, N1, Mx 13 BB 72 F pt3, N1, Mx 22 BR 80 F pt2, N1, M1 58 RP 58 M pt3, N0, Mx 28 Tutti i pazienti 63 8M/7F Adenocarcinoma duttale pancreatico 505

pt3, N1, Mx 37 RA 74 F pt3, N0, Mx 74 MM 54 F pt3, N0, Mx 5 PL 92 M pt3, N1, Mx 3 CM 57 M pt2, N1, M1 22 RA 51 F pt4, N1, Mx 13

11 Presenza di linfociti T ENOA-specifici in pazienti con AP (3%) 87 (97%) T ENOAspecifici CD4+ T ENOAspecifici CD (18%) (9%) 20 (15%) 221 Tutti i siti MS MT CT 56 (25%) Cloni T ottenuti Cloni T ENOA-specifici

ENOAspecifici CD8+ 300 200 100 0 90 (18%) 149 135 14 (9%) 20

12 Caratterizzazione funzionale dei linfociti T ENOA-specifici in pazienti con AP Cloni T CD8 + ENOA-specifici (Tutti i Siti) 60 53% Cloni T CD4 + ENOA-specifci (Tutti i Siti) Tc Null (CT) Tc0/Tc17 (MS) % 9% 14% 6% 5% 4% 0 Tc0 (CT) 67% IFN-γ 71% IFN-γ

53% Cloni T CD4 + ENOA-specifci (Tutti i Siti) 50 40 30 Tc Null

13 Distribuzione delle popolazioni di linfociti T CD4 + ENOA-specifici nei tre diversi siti del tumore pancreatico Circa il 73% di tutti i cloni Th17 erano in grado di produrre anche IFN-γ (Th1/Th17)

14 % Rilascio 51 Cr % Rilascio 51 Cr Valutazione dell attività citotossica perforino-mediata dei cloni T ENOAspecifici MS CT Tutti i cloni T helper producenti IFN-γ (tranne 4 Th0) lisavano la cellula bersaglio. Nessuno dei Th2, dei Tnull o dei Treg era capace di lisare le cellule B-EBV. 2 dei 3 cloni T ENOA-specifici CD8 + distruggevano le cellule bersaglio, mentre il clone Tc null non ne era capace. Il rilascio specifico di 51 Cr è molto più elevato da parte dei cloni Th17 e Th1 isolati da MS piuttosto che da quelli isolati da CT.

Nessuno dei Th2, dei Tnull o dei Treg era capace di lisare le cellule B-EBV.

15 Valutazione dell attività citotossica Fas-FasL mediata dei cloni T ENOA-specifici 45 degli 87 cloni CD4 + (51%) e 1 (Tc0) (33%) dei 3 cloni CD8 + erano in grado di indurre apoptosi nelle cellule bersaglio. Tra i 45 cloni T CD4 + capaci di indurre apoptosi nelle cellule Panc1, 37 erano Th1, 6 Th17, 2 Th0, ma nessuno era Th2, Treg o Tnull.

indurre apoptosi nelle cellule bersaglio.

16 Cellule Treg ENOA-specifiche inibiscono la proliferazione delle cellule T effettrici Il 75% (9/12) dei cloni Treg ENOA-specifici erano in grado di inibire la proliferazione di cloni T effettori ENOA-specifici

17 Rapporto Treg/Teffetrici ENOA-specifiche I pazienti con un rapporto di cellule Treg/T effettrici ENOA-specifiche basso tendono a sopravvivere più a lungo (più di 10 mesi), rispetto a quelli con un rapporto Treg/T effettrici più alto (meno di 10 mesi)

tendono a sopravvivere più a lungo (più di 10 mesi), rispetto

18 Conclusioni (1) presenza di cellule T ENOA-specifiche a livello tumorale in pazienti con adenocarcinoma pancreatico (~20%) Maggior parte producenti IFN-g Cellule T intratumorali ENOA-specifiche con profilo Treg Effetto immunomodulante del microambiente tumorale

Maggior parte producenti IFN-g Cellule T intratumorali

19 Conclusioni (2) Certi approcci terapeutici (vaccinazione con ENOA) potrebbero rappresentare una nuova ed efficace via per il trattamento di pazienti affetti da AP se impiegati in combinazione a strategie volte a contrastare gli effetti delle Treg e a migliorare le funzioni effettrici delle Th1/Th17.

pazienti affetti da AP se impiegati in combinazione a strategie volte a

20 Obiettivi futuri caratterizzare la funzionalità delle cellule T ENOA specifiche presenti nel sangue periferico dei pazienti con AP confronto lo studio dei differenti epitopi antigenici dell ENOA valutare l effetto immunoregolatorio del microambiente del tumore del pancreas

confronto lo studio dei differenti epitopi antigenici dell ENOA

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