A = εlc c = A/εl c = 0.2/38000 M -1 cm -1 1 cm c = M = 5 μm

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1 COME PROCEDO? Ho una soluzione di una proteina purificata Preparo un bianco con lo stesso tampone utilizzato per dissolvere la proteina Effettuo l azzeramento dello spettrofotometro con il bianco e poi una lettura del campione alla lunghezza d onda di 280 nm (se la proteina contiene amminoacidi aromatici) a 214 nm (se la proteina non contiene amminoacidi aromatici). In ogni caso devo utilizzare la lunghezza d onda di riferimento del coefficiente di estinzione molare. ε 280 per il LISOZIMA = M -1 cm Misuro un assorbanza = 0.2 Qual è la concentrazione? A = εlc c = A/εl c = 0.2/38000 M -1 cm -1 1 cm c = M = 5 μm

2 Dosaggio enzimatico 1.Dosare la quantità di un substrato che prende parte ad una reazione catalizzata da un enzima 2.Dosare l attività di un enzima, cioè la velocità di una reazione catalizzata da un enzima: Enzimi plasmatici a scopo diagnostico: un dosaggio degli enzimi nel plasma può essere utilizzato per diagnosticare il danno di un tessuto od organo particolarmente ricco in alcuni enzimi e l entità del rilascio enzimatico fornirà un indice del grado del danno cellulare. Carenze/difetti enzimatici responsabili di sindromi biochimiche

3 Come si misura l attività di un enzima? Si misura la variazione nel tempo di una qualsiasi grandezza correlata alla concentrazione del substrato o del prodotto, COME L ASSORBANZA. Velocità di reazione: quantità di substrato trasformato nel tempo v = - Δ[S] / Δt = Δ[P] / Δt Ass = εlc c = Ass/εl (legge di Lambert-Beer) La misura della variazione di Assorbanza nel tempo è la misura della velocità di reazione. Quando si vuole misurare la velocità di una reazione enzimatica si misura la variazione di Ass nella fase iniziale: v 0 (in questo intervallo il reagente si trasforma in prodotto alla massima velocità dopodiché la velocità diminuisce man mano che si instaura l equilibrio). v = Δc/ Δt v = ΔAss/ Δt εl

4 Dosaggio dell attività enzimatica (metodo diretto) Un esempio è il dosaggio della lattato deidrogenasi (LDH) in campioni biologici (fluidi o estratti tissutali) che catalizza la reazione: Si misura la diminuzione di assorbanza a 340 nm di NADH, ossi la diminuzione di [NADH] che equivale alla diminuzione di [piruvato] (sono in rapporto stechiometrico di 1:1). L Ass di NADH a 340 nm diminuisce perché NADH è trasformato in NAD +

5 L LDH è fatta reagire con una diversa [NADH] in una serie di esperimenti. Per ogni esperimento è calcolata la v 0 Ass (NADH) = εl [NADH] [NADH] = Ass (NADH) /εl v 0 = Δ[NADH]/ Δ t v 0 = Δ Ass/ Δ t = Tangente al tratto lineare della curva εl

6 I valori di v 0 vengono calcolati in una serie di esperimenti in cui è messa a reagire con l LDH una diversa [NADH] in modo da ottenere la curva cinetica di Micaelis/Menten o un grafico dei doppi reciproci. Posso ricavare Km, Vmax, Kcat

7 Migliori condizioni per fare il saggio dell ATTIVITA ENZIMATICA Lavorare il condizioni saturanti di substrato [piruvato] e [NADH] >>> [LDH] Condizioni: cinetica di ordine zero rispetto a S (velocità della reazione indipendente da S) variazioni di S o P lineari nel tempo se S>>>Et la Legge di Michaelis e Menten: V 0 = Vmax = kcat [Etot] ci assicura che la V 0 che ricaviamo sperimentalmente sia direttamente proporzionale a [Etot] ; Quando raggiungo V max V 0 dipende solo da [Etot] Posso ottenere le UNITA ENZIMATICHE di LDH: Quantità di enzima capace di trasformare 1 micromole di substrato al minuto quando [substrato] è saturante, il ph è ottimale per l enzima e la T = 30 C

8 2. Misurazione dell assorbanza a lunghezza d onda prefissata per analisi quantitative: b) Non conosco il coefficiente di estinzione molare, oppure ho una miscela di proteine Non posso utilizzare la legge di Lambert-Beer. Effettuo un saggio colorimetrico: le proteine presenti nel campione sono fatte reagire con un reagente dando origine ad un prodotto colorato. L intensità del colore sviluppato si correla con la concentrazione di proteina.

9 Saggi colorimetrici per la determinazione della concentrazione proteica 1. Metodo del BIURETO 2. Metodo di LOWRY (FOLIN-CIOCALTEAU) 3. Metodo di BRADFORD 4. Metodo dell ACIDO BICINCONINICO METODO DI BRADFORD Si basa sull interazione fra le proteine e il colorante: COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250 Esiste in 3 forme: Cationica (rossa) Neutra (verde) Anionica (blu) Quando interagisce con una proteina (in ambiente acido) il coomassie BB G-250 si converte nella forma anionica (blu) che ha un massimo di assorbimento a 595 nm A ph acido, è prevalente la forma cationica (2 cariche +) che ha un massimo di assorbimento a 465 nm. Il complesso proteina/colorante è rivelato a 595 nm, la sua assorbanza è proporzionale alla concentrazione della proteina

10 Proteina Complesso Proteina/colorante 595 nm Interazioni elettrostatiche con amminoacidi basici (arginina) e idrofobiche con i residui aromatici Coomassie BB G-250 Coomassie BB G proteine

11 Il saggio colorimetrico per la determinazione della CONCENTRAZIONE PROTEICA TOTALE si basa sulla costruzione di una RETTA STANDARD utilizzando le soluzioni a concentrazioni note di una proteina 1) Si preparano diverse soluzioni a concentrazioni scalari di BSA (Bovin Serum Albumin), nello stesso tampone in cui è contenuto il nostro campione a concentrazione x. Range utilizzabile: da 1 a 10 μg/ml (saggio su piastra) o da 50 a 1400 μg/ml (saggio in cuvette) per avere una linearità fra assorbanza e concentrazione. 2) Si prepara un certo volume del campione proteico a concentrazione incognita 3) Si prepara un BIANCO con il tampone in cui è dissolto il campione proteico 4) Si miscela il reattivo di Bradford con: il bianco, le soluzioni a titolo noto di BSA, il campione x. Campione proteico a concentrazione incognita 5) Si incuba a T ambiente per 5 minuti e poi si effettuano le letture allo spettrofotometro a 595 nm. X

12 6) Ai valori di A 595 nm delle soluzioni a conc. nota di BSA e della soluzione a conc. incognita si sottrae il valore di assorbanza del bianco (AZZERAMENTO). 7) Su un grafico si riportano i valori di assorbanza delle soluzioni di albumina in funzione della loro concentrazione e si ottiene una RETTA STANDARD. 8) Si riporta, quindi il valore dell assorbanza del campione a concentrazione x e si individua graficamente il valore della concentrazione corrispondente.

13 ESERCIZIO. L assorbanza per una soluzione contenente una miscela di NAD + e NADH è stata misurata a 340 nm e a 260 nm A 340 = e A 260 = 0.9 Conoscendo i coefficienti di estinzione: mm 340 NADH= 6.2 mm -1 cm -1 mm 260 NADH= 18 mm -1 cm -1 mm 260 NAD + = 18 mm -1 cm -1 Calcolare le concentrazioni millimolari della forma ossidata e ridotta