Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA. Angela Chambery Lezione 10

Transcript

1 Corso di Laurea in Farmacia Insegnamento di BIOCHIMICA Angela Chambery Lezione 10

2 Funzioni delle proteine Concetti chiave: La varietà strutturale delle proteine consente loro di svolgere un enorme quantità di ruoli biologici specializzati: Proteine strutturali Proteine di trasporto Proteine di protezione difesa Proteine di controllo e regolazione Proteine catalitiche (enzimi) Proteine per il movimento Proteine di riserva La struttura di una proteina determina la sua funzione biologica

3 Mioglobina ed emoglobina Concetti chiave: La mioglobina, con il suo singolo gruppo prostetico eme, ha una curva di legame per l'o 2 con andamento iperbolico. L'emoglobina può assumere la conformazione deossi (T) o ossi (R), che differiscono per affinità di legame per l'o 2. Il legame dell'ossigeno induce cambiamenti conformazionali nell'emoglobina in modo tale da consentire all'ossigeno di legarsi cooperativamente, generando un andamento sigmoidale della curva di legame. L'effetto Bohr e il BPG alterano l'affinità di legame per l'o 2 dell'emoglobina. Le mutazioni possono cambiare le proprietà di legame dell'o 2 dell'emoglobina e portare allo sviluppo di patologie.

4 Struttura della mioglobina di capodoglio La mioglobina è la prima proteina di cui è stata determinata la struttura ai raggi X da Kendrew. E costituita da 153 residui che fanno parte di otto α-eliche (A-H) che si organizzano a formare una proteina globulare. Il gruppo prostetico eme è saldamente associato ad una tasca idrofobica posta tra le eliche E ed F.

5 Il gruppo eme Il gruppo eme è costituito da uno ione metallico Fe(II) e una parte organica, la protoporfirina IX. Pirrolo La parte porforinica è costituita da 4 anelli a 5 atomi che hanno la struttura di base del pirrolo e sono uniti da ponti metinici (-CH=) a formare una struttura planare quadrata. Porfirina (C 20 H 14 N 4 )

6 Il gruppo eme Lo ione Fe(II) ha sei siti di coordinazione (forma sei legami di coordinazione) di cui quattro occupati dagli atomi di azoto degli anelli pirrolici, uno con l His F8. L ossigeno si lega al sesto sito di coordinazione del ferro.

7 Il complesso dell'eme nella mioglobina L His E7 forma un legame idrogeno con l ossigeno ed impedisce stericamente all ossigeno di legarsi con orientamento perpendicolare rispetto al piano dell eme. L eme viene mantenuto nella corretta posizione da interazioni idrofobiche con i residui di Val E11 e Phe CD1. Mioglobina PDBid 1MBO

8 Il complesso dell'eme nella mioglobina Il monossido di carbonio (CO) lega l eme isolato con un affinità volte superiore a quella dell O 2. Tuttavia, a causa dell impedimento sterico con l His E7 (distale), tale affinità è in realtà 200 volte superiore a quella dell O 2. Ciò impedisce che tracce di CO prodotte durante il metabolismo si leghino ai gruppi eme. In quantità maggiori il CO è un potente veleno. In alcune condizioni, il Fe può essere ossidato a Fe(III) formando metamioglobina o metaemoglobina (colore scuro carne vecchia o sangue secco). Il Fe(III) non è in grado di legare l ossigeno.

9 Curva di legame iperbolica della mioglobina all'ossigeno La funzione della mioglobina è quella di facilitare il trasporto dell O 2 nel muscolo e conservarlo per i momenti in cui la domanda energetica è elevata. A bassi valori di po 2 alla mioglobina si lega poco ossigeno. All aumentare della po 2 aumentano anche i siti di occupati dall O 2 fino a raggiungere la saturazione di tutti i siti di legame per l O 2 Poiché la po2 del sangue arterioso è 100 Torr e quella del sangue venoso è 30 Torr, la mioglobina è sempre quasi completamente saturata dall O2. p50 La mioglobina è dunque estremamente efficace nel favorire il passaggio dell O Torr

10 Struttura dell emoglobina L emoglobina, la prima proteina cui è stata assegnata una funzione fisiologica specifica (trasporto dell O 2 ), è un tetramero formato da un dimero di protomeri αβ.

11 Struttura dell emoglobina Le subunità dell emoglobina interagiscono attraverso interazioni idrofobiche non covalenti che coinvolgono 35 residui amminoacidici all interfaccia α1β1 (e α2β2) e 19 residui all interfaccia α1β2 (e α2β1).

12 Struttura dell emoglobina Le subunità αβ sono strutturalmente ed evoluzionisticamente correlate l una all altra e alla mioglobina sebbene solo il 18% dei residui siano identici.

13 Struttura dell emoglobina Le subunità αβ sono strutturalmente ed evoluzionisticamente correlate l una all altra e alla mioglobina sebbene solo il 18% dei residui siano identici.

14 Strutture della deossi- e della ossiemoglobina I protomeri sono correlati da un doppio asse di simmetria. L ossogenazione avvicina le due subunità β e sposta i contatti tra le subunità a livello delle interfacce α1β2 e α2β1

15 Spettri di assorbimento della deossi- e della ossiemoglobina Spettri di assorbimento di Hb, HbO 2 e metahb. Gli spettri che coprono le regioni del visibile (465 nma-700 nm) e del vicino ultravioletto (360 nma-450 nm; la cd. 'banda di Soret') Hb (curva rossa) HbO2 (curva blu) metahb (curva arancio)

16 Curva di legame iperbolica dell emoglobina all'ossigeno L emoglobina presenta una curva di legame con l ossigeno di tipo sigmoide. Poiché ha una p50 di 26 Torr, è completamente saturata di O 2 alla po 2 delle arterie (100 Torr) mentre alla po 2 delle vene (30 Torr) l emoglobina è saturata al 50%. Ipotetica proteina con la stessa p50 dell emoglobina p50 26 Torr

17 Cooperatività Una curva di tipo sigmoide è indicativa della presenza di interazioni cooperative tra i siti di legame, ovvero il legame di un ligando a un sito modifica le proprietà di legame di un altro ligando e così via.

18 Grafici di Hill per la mioglobina e per l'emoglobina L'equazione di Hill descrive la curva di legame all emoglobina dell O 2. Riarrangiando l equazione e facendo il logaritmo dei termini si ottiene un equazione lineare che può essere usata per stabilire la cooperatività del legame. n è il coefficiente di Hill. Per la Mb l andamento è lineare (n=1). Per l Hb si distinguono tre regioni. Quella intermedia (n 3) descrive una cinetica cooperativa.

19 Movimenti dell'eme e dell'elica F durante la transizione T R L emoglobina ha due stati conformazionali: lo stato T (deossimioglobina, blu) e lo stato R (ossiemoglobina, rosso). Nella forma T il Fe (II) è 0.6 Å al di fuori del piano dell eme che assume una forma a cupola. Nella forma R il Fe si muove verso il piano dell eme e la porfirina diventa planare. In questa posizione il Fe lega saldamente l O 2. L His F8 (prossimale) e l elica F seguono il Fe. Stato T Stato R

20 Movimenti dell'eme e dell'elica F durante la transizione T R

21 His F8 (prossimale) e His E7 (distale) Ingrandimento delle due istidine His F8 (prossimale) e His E7 (distale) conservate in tutte le globine.

22 Movimenti dell'eme e dell'elica F durante la transizione T R Movimento dell istidina prossimale nella forma R: il Fe si muove verso il piano dell eme e la porfirina diventa planare. L His F8 e l elica F seguono il Fe.

23 Movimenti dell'eme e dell'elica F durante la transizione T R Questo movimento altera la struttura di ogni subunità che a loro volta cambiano le interazioni tra le subunità nell'interfaccia.

24 Cambiamenti dell'interfaccia α1-β2 durante la transizione T R Le variazioni nella struttura terziaria sono accoppiate a una riorganizzazione delle 4 subunità dell emoglobina. Nella forma T, l His FG4 della subunità β2 si adatta ad una scanalatura dell elica C della subunità α1 vicino al residuo Thr C6. Nella forma R, l His FG4 si trova in una scanalatura un giro d elica più indietro, vicino al residuo Thr C3 della subunità α1.

25 Cambiamenti dell'interfaccia α1-β2 durante la transizione T R Nella transizione T R le modificazioni della struttura terziaria in una subunità non possono avvenire senza che ne risenta anche la struttura quaternaria dell intera proteina tetramerica. Lo stato T (Teso) è cosi chiamato perché presenta un numero superiore di legami non covalenti (ionici e a idrogeno), che mantengono la conformazione intrappolata nello stato T.

26 Cambiamenti dell'interfaccia α1-β2 durante la transizione T R Movimenti dei residui di Asp 94 α (elica FG1) e His 146 β (elica HC3)

27 Coppie ioniche e legami idrogeno nella deossiemoglobina Il reticolo di coppie ioniche dei residui al C-terminale dell Arg 141α e His146β stabilizzano lo stato T. La transizione T R rompe queste coppie ioniche.

28 Cooperatività Lo stato T presenta una bassa affinità per l O 2 a causa della maggiore lunghezza (0.1 Å) del suo legame Fe-O 2 rispetto a quello dello stato R. Quando una molecola di O 2 si lega a ciascun dimero αβ, la tensione nell Hb nello stato T, rompendo le coppie ioniche al C- terminale, induce la proteina a passare allo stato R che hanno maggiore affinità per l O 2. L emoglobina è una proteina allosterica (dal greco allos, altro, e stereos, solido o forma). E una proteina in cui il legame di un ligando a un sito modifica le proprietà di un altro sito sulla stessa molecola proteica.

29 L'effetto Bohr: l'influenza del ph sulla transizione T R L affinità per l O 2 dell emoglobina aumenta all aumentare del ph (effetto Bohr). Un aumento del ph (<[H + ]) induce l emoglobina a legare O 2 a pressioni di ossigeno inferiori. Una maggiore [H + ] favorisce il rilascio dell O 2 dall Hb

30 L'emoglobina e la mioglobina nel trasporto dell'o 2 e della CO 2 L O 2 inspirato nei polmoni a una elevata po 2 si lega all Hb nel sangue: l O2 è poi trasportato al muscolo dove la po 2 è bassa e quindi si dissocia dall Hb diffondendo nel tessuto dove è utilizzato per ossidare i carburanti metabolici a CO 2 e H 2 O. Nel tessuto muscolare in intensa attività di respirazione l O 2 si lega alla Mb (> affinità). L Hb e la CO 2 (in prevalenza come HCO 3- ) ritornano poi ai polmoni dove il biossido di carbonio viene eliminato.

31 L'emoglobina e la mioglobina nel trasporto dell'o 2 e della CO 2 Il biossido di carbonio modula inoltre il legame dell O 2 all Hb combinandosi in maniera reversibile con i gruppi amminici N- terminali delle proteine del sangue per formare carbammati: R-NH 2 + CO 2 R-NH-COO - + H + I protoni liberati dalla formazione di carbammato possono produrre il rilascio di altro O 2 attraverso l effetto Bohr.

32 Effetti del BPG e della CO 2 sulla curva di dissocciazione dell'o 2 dell Hb Il BPG negli eritrociti dei mammiferi determina una diminuzione dell affinità dell Hb per l O2, favorendo la forma deossigenata. In assenza di BPG nei capillari verrebbe rilasciata solo una piccola quantità di O 2 legato dal momento che l affinità per l O 2 è maggiore.

33 Il BPG si lega alla deossiemoglobina I gruppi anionici del BPG formano legami idrogeno e coppie ioniche con i gruppi N- terminali di entrambe le subunità β. Nello stato R la cavità centrale è troppo stretta per contenere BPG. L equilibrio T R viene spostato verso lo stato T determinando un abbassamento dell affinità dell Hb per l O 2

34 Composizione delle subunità dell Hb durante lo sviluppo

35 L emoglobina fetale ha una bassa affinità per l O 2 Il feto ottiene l O 2 dalla madre attraverso la placenta. Il BPG si lega più saldamente all Hb dell adulto che a quella fetale agevolando così il rilascio dell O 2 dai tessuti della madre a quelli del feto.

36 L emoglobina fetale ha una bassa affinità per l O 2 Nell emoglobina fetale le catena β sono sostituite dalle catene γ, che ha un residuo di Ser non carico in posizione 143 al posto dell His, eliminando così interazioni che stabilizzano il complesso BPG-deossiemoglobina.

37 L'adattamento alle elevate altitudini La pressione atmosferica diminuisce con l altitudine. L organismo risponde aumentando l Hb e gli eritrociti. Tale processo richiede però diverse settimane. Una risposta rapida consiste nell aumentare i livelli di BPG negli eritrociti. La conseguente diminuzione di affinità per l O 2 porta ad incrementare la quantità di O 2 rilasciata nei capillari.

38 Modello simmetrico dell'allosterismo (Monod-Wyman-Changeux) Gli stati T ed R sono in equilibrio, indipendentemente dal numero di molecole di ligando (S). Tutte le subunità sono nello stato T o nello stato R. Il modello non consente combinazioni di subunità negli stati T ed R.

39 Modello sequenziale dell'allosterismo (Koshland) Il legame del ligando induce man mano una modificazione conformazionale nelle subunità e la modificazione più evidente avviene in quelle subunità che legano il ligando. Al contrario di ciò che accade nel modello simmetrico, la simmetria oligomerica non viene mantenuta in tale processo.

40 Le mutazioni alterano la struttura e la funzione dell'emoglobina Sono state identificate più di 1000 varianti emoglobiniche, il 95% delle quali dovute a mutazioni puntiformi. Circa il 5% della popolazione mondiale possiede una variante emoglobinica che non porta sintomi clinici.

41 Le mutazioni alterano la struttura e la funzione dell'emoglobina

42 Eritrociti umani normali

43 Eritrociti umani falciformi

44 Struttura di una fibra di deossiemoglobina S La catena laterale della Val6, che sostituisce un rediduo di Glu6 nell Hb S nella catena β2 di una molecola di deossiemoglobina, si lega ad una tasca idrofobica sulla subunità β1 di una molecola di deossiemoglobina vicina. Si formano dunque dei filamenti insolubili che deformano gli eritrociti (a falce) che non sono più in grado di passare attraverso i capillari dove è maggiormente presente la deossihb.

45 La deossiemoglobina S: la Val 6 mutante interagisce con la Phe 85 La tasca idrofobica è assente nell ossihb, quindi sia l Hb normale che l ossihb S non polimerizzano.

46 Fibre di deossiemoglobina S Fibre di deossiemoglobina S che fuoriescono da un eritrocita rotto.

47 Il trattamento con idrossiurea per l'anemia falciforme La somministrazione di idrossiurea allevia i sintomi dell anemia falciforme aumentando mediante un meccanismo non ancora noto la quantità di Hb fetale che contiene subunità γ invece delle subunità β difettose. L Hb fetale diluisce l Hb S rendendo più difficile il processo di aggregazione.

48 Malaria ed emoglobina S Il Plasmodium falciparum aumenta l acidità delle cellule infettate. Per effetto Bohr aumenta la formazione di deossi Hb causando un concomitante aumento della formazione di fibre e deformazione dei globuli rossi che contengono Hb S. Gli eritrociti danneggiati vengono rimossi dalla circolazione ad opera della milza.