Laboratorio di diagnostica Molecolare Dipartimento di Patologia Sezione di Anatomia Patologica Università di Verona

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1 Laboratorio di diagnostica Molecolare Dipartimento di Patologia Sezione di Anatomia Patologica Università di Verona Il tecnico di laboratorio biomedico: Applicazioni nel laboratorio di anatomia patologica Verona 12,13 Marzo 2008 Maria Scardoni La biologia molecolare: principi ed applicazioni in anatomia patologica

2 Biologia molecolare non solo PCR Le scienze OMICHE DNA RNA PROTEINE METABOLITI GENOMICA TRASCRITTOMICA PROTEOMICA METABOLOMICA Zinc finger Relazioni fra molecole Zinc ions Finger

3 Il dogma centrale della biologia molecolare (F. Crick 1958) DNA makes RNA makes protein DNA RNA PROTEINA questo è riduttivo

4 Tutto quello che si fa con DNA o RNA in laboratorio sfrutta sempre ben precise caratteristiche degli acidi nucleici DNA = acido 2-desossiribonucleico Catene antiparallele destrogire Direzionalitàda5 a 3

5 O - O - O - - O γ β α P O P O P O O O Phosphate O 5 CH 2 Base O 4 H H 1 H 3 H 2 OH H Sugar Legame fosfodiesterico direzione di sintesi: da 5 a 3

6 2-desossiribosio Legame fosfodiesterico

7 Ma perchè proprio una doppia elica?

8 Doppia elica dovuta alle basi azotate Adenina Guanina Timina Citosina A G T C

9 T A Legami idrogeno C G

10 James D Watson Photo 51 Francis H Crick Modello della doppia elica proposto nel 1953 Nobel 1963 Filamento Watson/Crick

11 James D Watson Photo 51 Francis H Crick Rosalind Franklin

12 Tornando alla scala del DNA... Gruppi fosfato carica negativa Fra le basi etidio bromuro

13 L RNA invece... Adenina Guanina Citosina Uracile invece di Timina Ribosio Direzionalità 5 3

14 Non forma doppia elica ma può ripiegarsi e formare tratti double strand intracatena mrna trna rrna..

15 Ricapitolando: Complementarietà Direzionalità Carica negativa Struttura a scala Queste le peculiarità che si sfruttano in lab. Ma vediamo alcuni esempi

16 Complementarietà e direzionalità Ibridazione Ibridazione: appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari Complementarietà: 2 sequenze nucleotidiche sono complementari se ogni A si appaia con T e ogni C si appaia con G

17 Ibridazione in situ

18 Ibridazione su carta - Southern blotting - Strips

19 DNA array: migliaia di ibridazioni

20 La PCR: Appaiamento per complementarietà con formazione di ponti idrogeno Rottura legami idrogeno e apertura eliche Ripetuto in media cicli!

21 Quello che accade in natura... e in lab La cellula duplica il proprio DNA e lo divide equamente nelle cellule figlie In PCR facciamo copie di un segmento di DNA datp dgtp Taq dttp dctp Templato Primers dntps Taq polimerasi n copie

22 Mullis has described how he got the idea for the PCR during a night drive in the Californian mountains.

23

24 Dopo aver amplificato con PCR è necessario visualizzare i prodotti ottenuti Dopo aver eseguito il protocollo di ibridazione è necessario visualizzare l avvenuta ibridazione (vedi dopo con FISH) COME? Con una corsa elettroforetica

25 Separazione elettroforetica: migrazione di molecole cariche sottoposte ad un campo elettrico continuo attrazione verso il polo di carica opposta il DNA carico negativamente migra verso il polo positivo

26 Corsa (separazione) elettroforetica Versare fino a coprire il gel Pozzetto dove si carica il campione Tampone gel direzione campo elettrico direzione migrazione Elettrodo - Elettrodo +

27 La separazione elettroforetica avviene all interno di setacci molecolari : - gel di agarosio - gel di acrilamide molecole piccole veloci molecole grandi lente

28 A fine corsa elettroforetica non vedo ancora il DNA... ma

29 Come appare il DNA colorato

30 Elettroforesi di ultima generazione

31 Ricostruzione virtuale su video della corsa elettroforetica su gel DNA RNA

32 La corsa elettroforetica: gel verticali di acrilamide sistemi capillari

33 A Verona: Monoclonalità linfomi T/B Determinazione HPV (PCR e ibridazione) Determinazione TBC Microsatelliti Sequenziamento in sindromi familiari: MEN 1, MEN 2 SPINK1, PRSS1 VHL

34 PCR per NHLB M Bx C+ M Bx C+ Ki-ras PCR-B monoclonale policlonale policlonale

35 PCR multipla per HPV da campioni in paraffina M Bx Bx Bx C+ HPV β actina

36 PCR per MEN 2 campione 1 φx 174 HaeIII (pesi in Kb) campione / Exons gene RET

37 DNA RNA Trascrittasi inversa PCR c-dna HCV: virus a RNA M Bx Bx C+ C+ PCR Atteso 194 bp

38 Sequenziamento del DNA T A C G

39 Perchè conoscere la sequenza del DNA? DNA RNA Proteina variazioni di sequenza = mutazioni DNA mutato Proteina o non funzionale

40 Sequenziamento: determinare l esatta l sequenza di basi nucleotidiche in un segmento di DNA di interesse Ci sono due metodi: 1.Metodo enzimatico Sanger 2.Metodo chimico Maxam Gilbert

41 Si basa sulla possibilità di sintetizzare una copia fedele e complementare di uno dei due filamenti di un DNA stampo Nella miscela di reazione sono presenti accanto ai nucleotidi trifosfati (dntps) gli stessi in forma dideossi (ddntps)

42 Cosa succede durante la sintesi L aggiunta di uno qualsiasi dei dntps ( nucleotidi normali ) fa allungare la catena L aggiunta di uno qualsiasi di ddnpts interrompe la sintesi della catena Perche?

43 Rivediamo in che modo è costruita una emielica di DNA

44 DNA stampo denaturazione TGTTCCCAGAGGGCAAT? datp copia fedele e complementare ddatp

45 se é aggiunto un dideossi (ddntp) dda TGTTCCCAGAGGGCAAT se é aggiunto un dntp TGTTCCCAGAGGGCAAT A? dctp ddctp TGTTCCCAGAGGGCAAT AC datp? ddatp

46 La reazione di sequenza viene fatta utilizzando diverse temperature Si usano i termociclatori ma è una neosintesi che non ha il carattere esponenziale della PCR

47 Sono sintetizzati una serie di segmenti ciascuno più lungo del precedente di una base: quella terminatrice DNA polimerasi I primer datp dgtp dttp dctp ddatp ddgtp ddctp ddttp DNA a singolo filamento da sequenziare 5 3 A T C T T GG T G C A T C C G G A T C G A C C A A G A T A T

48 I nucleotidi dideossi quindi. 1.Mancano dell ossidrile in posizione 3 e ciascuno è legato chimicamene a un gruppo fluoroforo diverso 2.Non solo interrompono la sintesi ma l ultimo nucleotide è colorato ddatp ddgtp ddctp ddttp

49 Uso di nucleotidi legati a fluorofori ddatp ddgtp ddctp ddttp TACACCCAGAGGTC A A T AT G AT GT AT GT G AT GT G G AT GT G G G AT GCT G G G T AT GT G G G T C AT GT G G G T C T AT GT G G G T C TC AT GT G G G T C TC C AT GT G G G T C TC C A AT GT G G G T C TC C A G Peso molecolare Separabili con elettroforesi

50 Software per identificare la base terminatrice che emette fluorescenza dopo eccitazione con laser Frammento più grande 3 5 elettroforesi usando un laser per attivare la fluorescenza dei ddntp e un sensore per distinguere i colori Frammento più piccolo T AGAACCACGTAG G T T A G A A C C A C G T A G G T 5 Sequenza del templato A T C T T G G T G C A T C C A 3

51 Protocollo 1. Estrazione DNA 2. PCR 3. Purificazione prodotti di PCR 4. Reazione di sequenza 5. Purificazione post sequenza 6. Separazione elettroforetica 7. Analisi risultati

52 Reazione di amplificazione PCR N copie prodotte

53 Purificazione degli amplificati in PCR Elimino reagenti inutilizzati Aggiungere Le biglie magnetiche AMPure Separazione magnetica Fare due lavaggi Eluire

54 Reazione di sequenza (metodo Sanger) Primer + DNA stampo + datp dgtp ddatp ddgtp dttp dctp ddttp ddctp Mix dntps/ddntps + Enzima + Opportune condizioni di temperatura

55 Purificazione delle reazioni di sequenza (biglie) per togliere reagenti inutilizzati Corsa elettroforetica G A C C TC T G G G T GT A

56 Elettroforesi capillare

57 I segnali sono come elettroferogramma rielaborati e mostrati

58 SPINK1 mut. (AAT-AGT) N34S Campione1 Campione2 Controllo

59 PRSS1 polim. (AAT-AAC) N246N Controllo Non cambia l aminoacido Campione1 Campione2 Campione3

60 Applicazioni sindrome VHL sindrome MEN 1 sindrome MEN 2 Pancreatite geni SPINK1 PRSS1

61 MEN 2 Seq. gene RET Mutato = 100% sviluppo neoplasia Familiari follow up

62 Grazie