Vol. VII Giugno 2012 N 3

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1 Vol. VII Giugno 2012 N 3 FACE SCULPTURE: ARMONIZZAZIONE MEDICA DEI VOLUMI DEL VOLTO Maurizio Ceccarelli (International Centre for Study and Research in Aesthetic and Physiological Medicine Roma - Italia) Roberto Tullii (Clinica Valian San Paolo Brasile) Il concetto di armonia del volto prevede una triangolarizzazione di questo e cioè l esaltazione della porzione zigomatica e la diminuzione della porzione mento-buccale. Questo può essere facilmente ottenuto per la porzione superiore del volto, con l aumento dei volumi zigomatici, ma difficilmente ottenibile per la porzione inferiore, dove bisogna diminuire i volumi. La recente introduzione della tecnica di diminuzione del numero di cellule basata sull attivazione dell apoptosi cellulare, consente di ottenere questo risultato, completando il processo di armonizzazione del volto. Il protocollo del Face Sculpture prevede: l aumento del volume dell osso zigomatico e malare, l aumento del volume del grasso a livello della Bolla di Bichat (se necessario) la diminuzione del volume del grasso nella porzione laterale ed inferiore della bocca. L aumento del volume dell osso zigomatico e malare si ottiene utilizzando i principi del Full Face Regeneration per la neoformazione di osso con un osteoprotesi autologa. Rispettiamo la composizione biologica dell osso caratterizzata da una componente proteica (collagene) unita ad una componente inorganica (idrossiapatite). La componente proteica si prepara denaturando le proteine plasmatiche del paziente formando il Supporto Tessutale Biologico Autologo (STBA). Questo si ottiene eseguendo un prelievo del sangue del paziente, separando il plasma e denaturando con il calore le proteine in esso contenute. La componente inorganica si reperta da un medical device contenente 500 mg d idrossiapatite con una granulometria di micron. Si mescolano 2,5 ml di plasma con i 500 mg d idrossiapatite, ottenendo una omogenea sospensione formata da proteine autologhe con idrossiapatite al 20%. La sospensione si riscalda a C per indurre la denaturazione proteica e stabilizzare la sospensione preparata. Questa si inserisce a livello del periostio dell osso che si vuole aumentare di volume. Si disegnano sul volto del paziente le due linee di Hinderer (la prima, dal margine esterno dell occhio al margine esterno della bocca e, la seconda, dal margine inferiore della narice al margine superiore del trago). Nel punto d intersezione, si etra perpendicolarmente con un ago 21G fino a toccare l osso; si ruota l ago e si procede immediatamente al di sopra del periostio dell osso da trattare. Si distribuisce 1 ml della sospensione sull osso, muovendo a raggiera l ago. Terminata la deposizione del prodotto, si effettua un massaggio per distribuire e d uniformare la sospensione sopra il periostio. La parte proteica viene rapidamente riassorbita e metabolizzata, mentre l idrossiapatite permane per un tempo sufficiente a stimolare la

2 neoformazione di collagene fibrotico con aumento di volume. Il risultato viene controllato dopo giorni ed il trattamento viene ripetuto sino al risultato estetico. L idrossiapatite viene nel tempo metabolizzata per azione dell anidrasi carbonica cellulare. Questo enzima decompone l acido carbonico liberando ioni idrogeno che portano alla solubilizzazione dell idrossiapatite con liberazione di calcio e fosfato. Per l incremento del volume del tessuto adiposo (questo trattamento non è frequentemente richiesto) abbiamo due possibilità. O effettuiamo un liposowing con le cellule staminali adulte (transit amplyfing cells) del tessuto adiposo del paziente. Oppure stimoliamo la moltiplicazione delle cellule staminali adulte direttamente nel volto. La tecnica di Liposowing non usa normali cellule adiposo ma, principalmente, cellule staminali del grasso. Queste vengono seminate in piccole quantità per stimolare la nascita di nuovo tessuto adiposo. Il grasso è molto ricco in cellule staminali. Una cellula ogni 50 è una cellula staminale (contro il midollo osseo che ne contiene 1 ogni 10000). La spiegazione del perché il grasso è così ricco in cellule staminali va ricercata nella necessità di accumulare energia da parte del tessuto adiposo anche in uno stato di adipociti ipertrofici. L adipocita è capace di aumentare notevolmente il suo volume per raccogliere energia sotto forma di trigliceridi. Ma quando il suo volume è molto elevato (superiore al 170% del volume normale) l adipocita stimola la formazione di nuovo tessuto adiposo attivando la differenziazione delle cellule staminali presenti a livello dello stroma vascoloconnettivale. Lo stimolo alla moltiplicazione e alla differenziazione delle cellule staminali è dato principalmente dall aumento della concentrazione tessutale di insulina e di IG-F. L aumento del volume adipocitario oltre certi limiti induce l internalizzazione del recettore dell insulina con aumento della concentrazione periadipocitaria di questo ormone e la secrezione di IG-F. Le cellule staminali, stimolate dall insulina e dall insuline growth factor, si moltiplicano e si differenziano in adipoblasti, preadipociti e adipociti. Sulla base di quanto esposto, il Liposowing prevede: 1. Stimolazione della zona di prelievo del grasso con soluzione glucosata ed insulina pronta, per aumentare il volume adipocitario. 2. In minuti abbiamo l incremento del volume adipocitario per sintesi di trigliceridi. Aspettiamo 4 ore per consentire che il messaggio degli adipociti ipertrofici induca la moltiplicazione cellulare. 3. Dopo 4 ore effettuiamo un anestesia locale della zona di prelievo con Soluzione di Klein (soluzione fisiologica, anestetico locale con adrenalina, bicarbonato di sodio). 4. Allo sbiancamento del tessuto si effettua il prelievo con ago da 16 G per consentire la raccolta della frazione stromale ricca di cellule staminali. 5. Si separa il grasso dal liquido infiltrato e si impianta. 6. Per l impianto si usano piccole cannule (2,1 mm). 7. L impianto viene eseguito distribuendo delle piccole quantità di grasso con cellule staminali all interno del tessuto adiposo del volto per consentire la regolazione della moltiplicazione cellulare per controllo paracrino con le altre cellule adipose. Possiamo, anche, aumentare il numero di adipociti direttamente nella zona del volto carente, utilizzando il Metabolic Increase. In questo caso, facciamo fare un pasto grasso alla paziente. Dopo 2-4 ore abbiamo un alta concentrazione di acidi grassi circolanti nel sangue. A questo punto, infiltriamo piccole quantità di soluzione glucosata con insulina rapida, direttamente nel grasso delle zone ipotrofiche. L aumento di trigliceridi porta ad aumento del volume degli adipociti e, quando il volume supera il 170% del normale, si ha lo stimolo alla moltiplicazione delle cellule staminali adulte adipose. Le cellule staminali si moltiplicano e si differenziano, portando ad un aumento nel numero degli adipociti e all incremento dello spessore del tessuto adiposo del volto.

3 La riduzione del volume del grasso si effettua con la recente tecnica dell Apoptosi degli Adipociti. L Apoptosi degli Adipociti nasce alla fine del 2011, dalla collaborazione scientifica del Prof. Roberto Tullii con il Prof. Maurizio Ceccarelli ed è stata presentata per la prima volta a livello internazionale nel gennaio 2012, a Los Angeles, in un Corso di Formazione tenuto dal Prof. Maurizio Ceccarelli per l American Association of Aesthetic Medicine & Surgery. In occasione del quale il Prof. Ceccarelli ha ricevuto il titolo di Charman of Regenerative Medicine. La tecnica si basa sull induzione della morte spontanea cellulare utilizzando una particolare concentrazione di acido ascorbico in presenza di ferro ferrico. Il termine apoptosi deriva dal greco ed indica la caduta dei petali da un fiore che muore. In biologia si utilizza per definire un particolare processo che porta a morte programmata una cellula. La particolarità dell apoptosi, che la differenzia dalla necrosi cellulare, è l assenza d infiammazione. La cellula viene fagocitata dai macrofagi senza liberazione di mediatori infiammatori. L Apoptosi è caratterizzata da una serie di eventi biochimici che portano ad alterazioni cellulari caratteristiche e alla morte. Questi cambiamenti includono il blebbing, il restringimento delle cellule, la frammentazione nucleare, la condensazione della cromatina e la frammentazione del DNA cromosomico. A differenza della necrosi, che è una forma di morte cellulare traumatica che deriva dalla lesione cellulare, l'apoptosi produce frammenti di cellule chiamate corpi apoptotici che i fagociti sono in grado d inglobare e rimuovere rapidamente prima che il contenuto della cellula possa riversarsi verso le cellule circostanti e causare danni. Una cellula avvia l attivazione intracellulare apoptotica in risposta ad uno stress o di un danno non riparabile. Il processo è caratterizzato da un attivazione a cascata di enzimi, controllata da proteine regolatrici che possono interrompere il percorso in ogni momento. Molti percorsi e segnali portano all'apoptosi, ma sempre con lo stesso meccanismo intracellulare. Le proteine d induzione dell apoptosi (TNF-R1, Fas) provocano rigonfiamento mitocondriale attraverso la formazione di pori della membrana e aumentano la permeabilità della membrana mitocondriale. Proteine mitocondriali conosciute come SMACs vengono rilasciate nel citosol a seguito di questo aumento della permeabilità. Le SMAC si legano all inibitore delle proteine dell apoptosi (IAP) e lo disattivano, impedendo allo IAP di arrestare il processo apoptotico e quindi permettendo l'apoptosi di procedere. Lo IAP normalmente sopprime l'attività di un gruppo di proteasi chiamato caspasi. Ci sono due tipi di caspasi: caspasi iniziatrici ( 8,10,9,2) e caspasi effettrici ( 3,7,6). Le caspasi effettrici attivate stimolano una serie di proteine intracellulari (endonucleasi, proteasi) ad effettuare il programma di morte cellulare. Dai mitocondri è rilasciato il Citocromo c, questo, una volta rilasciato, si lega con il fattore di attivazione delle proteasi apoptotiche-1 (Apaf- 1) alla pro-caspasi-9 per creare un complesso conosciuto come apoptosoma. E la forma attiva della caspasi-9, che attiva l'effettore caspasi- 3. Le cellule danneggiate dall apoptosi vengono eliminate dai fagociti in un processo definito efferocitosi. Il danno apoptosico porta all espressione sulla superficie cellulare di strutture dette corpi apoptosici caratterizzati dalla fosfatidilserina, sulla loro superficie. La fosfatidilserina si trova normalmente sulla superficie citosolica della membrana plasmatica, ma viene ridistribuita durante l'apoptosi sulla superficie extracellulare. Queste molecole sono uno stimolo per la fagocitosi da parte dei macrofagi. La rimozione delle cellule da parte dei fagociti avviene in modo ordinato senza provocare una risposta infiammatoria.

4 Abbiamo due vie di attivazione dell apoptosi, una intrinseca (della quale ci occuperemo) ed una estrinseca. Nella via intrinseca, l aumento della concentrazione intracellulare di ioni calcio porta ad un aumento di permeabilità dei mitocondri come detto, porta alla fuoriuscita del citocromo c, normalmente presente nell interno del mitocondrio. Il citocromo c si lega alla procaspasi, un enzima normalmente presente nella cellula in forma inattiva, attivandolo. Ne segue una serie di attivazioni a cascata delle caspasi. La cascata delle caspasi porta all attivazione finale della caspasi 3 che induce la morte cellulare. In particolare, la morte cellulare avviene per attivazione finale di endonucleasi, che frammentano il nucleo, e di proteasi, che dividono la cellula in piccole porzioni (i corpi apoptosici) e liberano sulla superficie della cellula dei residui di fosfatidilserina. I residui di fosfatidilserina rendono eterologhi i corpi apoptosici stimolandone la fagocitosi e la digestione. In letteratura troviamo molti lavori scientifici che ci dicono che gli antiossidanti svolgono questo ruolo di protezione della cellula a piccole dosi, mentre, ad alti dosaggi, diventano proossidanti. Anche l acido ascorbico, la vitamina C, presenta questa caratteristica: è pro-ossidante ad alti dosaggi. In presenza di metalli di transizione (ferro trivalente) l acido ascorbico attiva la Reazione di Fenton con liberazione di radicali liberi di tipo ossidrilico (FASEB J Jun;13(9): Does vitamin C act as a prooxidant under physiological conditions? Carr A, Frei B.). L aumento di radicali liberi determina, a livello cellulare, l attivazione dei canali del calcio con aumento intracellulare di questo ione (Mol Pharmacol Sep;34(3): The effect of oxygen free radicals on calcium permeability and calcium loading at steady state in cardiac sarcoplasmic reticulum. Okabe E, Odajima C, Taga R, Kukreja RC, Hess ML, Ito H.). Abbiamo già detto che l aumento di ioni calcio porta ad aumento di permeabilità dei mitocondri con liberazione del citocromo c ed attivazione della cascata delle caspasi. In The Effect of Local Injection with Vitamin C to Adipocytes Apoptosis pubblicato nel Journal of Chinese Medicine Research, Gao Yan, Wei Qiang, Chen ShiHai affermano che dosaggi di vitamina C tra lo 0,12% e lo 0,24% inducono il processo di apoptosi se infiltrati negli adipociti. In Relationship Between Ascorbyl Radical Intensity And Apoptosis-Inducing Activity pubblicato su Anticancer Res Sep- Oct;16(5A): , Sakagami H, Satoh K, Ohata H, Takahashi H, Yoshida H, Iida M, Kuribayashi N, Sakagami T, Momose K, Takeda M. ci riferiscono che l apoptosi cellulare è indotta da concentrazioni di acido ascorbico comprese tra 1 e 10 mmol. Un grammo di vitamina C corrisponde a 5,68 mmol, quantità sufficiente ad indurre apoptosi. Da quanto esposto, l introduzione di una quantità sufficiente di acido ascorbico, in presenza di ioni ferrici, nel tessuto adiposo induce l attivazione della Reazione di Fenton con liberazione di radicali liberi, con induzione del processo apoptosico e riduzione del numero di adipociti. All inizio della sperimentazione abbiamo utilizzato 1 grammo di vitamina C con aggiunto 0,5 ml di anestetico ed una goccia di ferro ferrico. La preparazione si iniettava volume per volume. Il trattamento, però, presentava una negatività e, cioè, la comparsa di un edema che permaneva per 3-4 giorni. Ma perché un edema se non c era risposta infiammatoria? Anche se il risultato finale era importante, l edema creava un problema per la vita sociale della paziente. Abbiamo voluto capire se questo edema era conseguente alla osmolarità della soluzione che iniettavamo.

5 L Equazione di Van t Hoff mette in relazione il valore della pressione osmotica con la concentrazione molare della soluzione. La soluzione fisiologica (cloruro di sodio allo 0,9%) è così chiamata perché non interferisce sull equilibrio osmotico dei tessuti. Infatti il calcolo della sua pressione osmotica ci da il valore di 310 mosm/l. Lo stesso calcolo, applicato per la nostra soluzione apoptotica ci dava un valore ben 7 volte maggiore. Ecco spiegata la risposta edematosa. Per questo, abbiamo diluito la nostra soluzione fino ad un valore quasi fisiologico di 450 mosm/l. Quindi, oggi, utilizziamo un millilitro, della fiala di Vitamina C aggiunta di 1 goccia di ferro, diluito con 4 ml di acqua distillata e 0,5 ml di anestetico. In pratica, aggiungiamo una goccia di ferro ferrico alla fiala di vitamina C da un grammo. Di questa preparazione preleviamo 1 ml, aggiungiamo 4 ml di acqua distillata e 0,5 ml di anestetico. Iniettiamo volume per volume nella zona in eccesso. L importanza del risultato ha portato il Prof. Tullii a provare il trattamento anche nel grasso orbitario Iniettando in ciascuna delle borse di grasso della palpebra inferiore 0,05 ml di soluzione con un ago 30G 4 mm. L ago si introduce perpendicolarmente, direttamente sopra il margine dell arcata orbitaria. Bibliografia Alberts, Keith; Johnson, Alexander; Lewis, Julian; Raff, Martin; Roberts; Walter, Peter (2008). "Chapter 18 Apoptosis: Programmed Cell Death Eliminates Unwanted Cells". Molecular Biology of the Cell (textbook) (5th ed.). Garland Science. p Ceccarelli M, García J. V., Il Medical Face Lifting: Rigenerazione dei Tessuti del Volto, The Physiological Medical Letter Vol. I Gennaio 2010 N 1 Cyrelys Collazo, Osmani Chacón, Orlando Borrás (2006). "Programmed cell death in plants resembles apoptosis of animals". Biotecnología Aplicada 23: Dejean LM, Martinez-Caballero S, Manon S, Kinnally KW (February 2006). "Regulation of the mitochondrial apoptosis-induced channel, MAC, by BCL-2 family proteins". Biochim. Biophys. Acta 1762 (2): Gao Yan Wei Qiang Chen ShiHai, The effect of local injection with vitamin C to adipocytes apoptosis, Journal of Chinese Medicine Research, 2009 Vol. 9 No. 6 pp Okabe E, Odajima C, Taga R, Kukreja RC, Hess ML, Ito H. The effect of oxygen free radicals on calcium permeability and calcium loading at steady state in cardiac sarcoplasmic reticulum. Mol Pharmacol Sep;34(3): Sakagami H, Satoh K, Ohata H, Takahashi H, Yoshida H, Iida M, Kuribayashi N, Sakagami T, Momose K, Takeda M., Relationship between ascorbyl radical intensity and apoptosisinducing activity, Anticancer Res Sep- Oct;16(5A): Terri Sundquist, M.S., Rich Moravec, B.S., Andrew Niles, M.S., Martha O brien, Ph.D., And Terry Riss, Ph.D., Timing Your Apoptosis Assays, Cell Notes Issue Apoptosis Interest Group (1999). "About apoptosis". Retrieved Carr A, Frei B Does vitamin C act as a prooxidant under physiological conditions? FASEB J Jun;13(9):